As101: Микком-ИСБ — Комплекс безопасности AS101

Средняя задержка прибытия

Задержка прибытия в %

Статистика задержек построена на информации о задержках 11 рейсах.

Календарь низких цен на авиабилеты

История рейса Alaska Airlines – AS101

Сб. 13 фев
–		–
SEA	Boeing 737-900 (N284AK)	ANC
Пн. 10 авг
15:46		17:57
SEA	Boeing 737-900 (N293AK)	ANC
Вс. 9 авг
15:40		17:45
SEA	Boeing 737-900 (N293AK)	ANC
Ср. 25 мар
16:38		18:54
SEA +31 м.	Boeing 737-900 (N309AS)	ANC +47 м.
Ср. 18 сен
07:18		09:34
SEA	Boeing 737-900 (N319AS)	ANC
Вт. 17 сен
07:38		09:54
SEA	Boeing 737-900 (N486AS)	ANC
Вт. 23 июл
07:04		09:00
SEA	Boeing 737-900 (N274AK)	ANC
Пн. 22 июл
07:11		09:05
SEA	Boeing 737-700 Passenger (N615AS)	ANC
Вт. 16 июл
07:11		09:25
SEA	Boeing 737-700 Passenger (N612AS)	ANC
Пн. 15 июл
07:13		09:17
SEA	Boeing 737-800 (N586AS)	ANC
Ср. 19 июн
07:20		09:39
SEA	Boeing 737-700 Passenger (N614AS)	ANC
Вт. 18 июн
07:35		09:50
SEA	Boeing 737-700 Passenger (N607AS)	ANC

Показать еще

Код-шеринг рейсы

Korean Air

Korean Air

American Airlines

American Airlines

Korean Air

American Airlines

Emirates

Типы и модели воздушных судов выполняющие рейс AS101

Информация о типах, моделях и бортовых номерах воздушных судов выполняющие рейс AS101. Также данный раздел содержит информация о процентном соотношение по типам и бортовым номерам воздушных судов чаще всего выполняющие рейс AS101. Проще говоря какие воздушные суда чаще выполняют рейс.

Boeing 737-900

25%

Boeing 737-800

20%

Boeing 737-700 Passenger

54%

Другие рейсы по маршруту Сиэтл — Анкоридж

Статистика по рейсу Сиэтл — Анкоридж

График отображает кол-во рейсов по маршруту Сиэтл — Анкоридж за последние 30 дней.

AS101 осциллограф 10 МГц, 1 канал, OWON

AS101 осциллограф 1 х 10 МГц

AS101 –  одноканальный осциллограф начального уровня, производства компании OWON.  

Осциллограф AS-101 OWON является, пожалуй самым простым, если таковое определение уместно, осциллографом. обладает полосой пропускания  10 МГц, и скоростью выборки в 100 МВ/с. Доступны для пользователя основные условия синхронизации – по уровню.

Но так как предназначен для учебных заведений то реализована одна из важных функций для обучения – фигуры Лиссажу.

ОСОБЕННОСТЬ осциллогафа OWON AS101:

• одноканальный осциллограф +  внешний вход синхронизации EXT.
• Входная чувствитеьность: 5 мВ – 10 В/дел
• Частота дискретизации: 100 МВ/с в реальном масштабе времени
• Диапазон входных напряжений: до 400 В.
 

Технические особенности виртуального осциллографа OWON AS101:

• Полоса пропускания, и количество каналов: 10 МГц х 1 канал,  +  вход внешней синхронизации

• Импеданс входа: 1МОм, 25пФ

• Скорость выборки (АЦП): 100 МВ/с (в реальном масштабе времени) 

• Чувствительность по вертикали: 5 мВ/дел – 10 В/дел 

• Развёртка во времени: 50 нс/дел – 0,1 с/дел.

• Режим отображения осциллограмм: XY (для построения фигур Лиссажу) , XT.

 Режим синхронизации: по уровню

• Габариты:  117 мм  x 192 мм x 288 мм, масса: 1,8  кг.

• Питание: 220В, 50 Гц, 15 Вт.

Детальные технические характеристики и руководство пользователя  осциллографа OWON AS101 (pdf. eng.)

Купить виртуальный осциллограф OWON AS101 можете в нашем интернет магазине cityset.com.ua.

Стандартная комплектация:

• Осциллограф OWON AS101 – 1 шт. • Пробники осциллографические -1 шт. • Руководство пользователя – 1 шт. • Гарантийный талон – 12 месяцев.

В случае имеющихся вопросов относительно функциональных возможностей, просьба обратится к нашему техническому специалисту по указанным выше телефонам.

USB-флэш накопитель A-Data Superior S101 16GB (AS101-16G-RBK)

Основные характеристики

Выдвижной коннектор

Пылевлагозащитный корпус

Заметили ошибку или неточность в описании товара? Сообщите нам, пожалуйста.

Влияние нового соединения теллура AS101 на аутоиммунные заболевания

Основные моменты

•

Небольшое нетоксичное соединение теллура AS101 снижает аутоиммунную активность.

•

AS101 подавляет функцию Th27 / IL-17 в аутоиммунной среде.

•

AS101 ингибирует специфические интегрины, которые имеют решающее значение для экстравазации лейкоцитов.

•

Соединение Te (такое как AS101) является многообещающим кандидатом для лечения аутоиммунных заболеваний.

Abstract

Теллур – редкий элемент, который считается второстепенным микроэлементом, несмотря на его относительное содержание в организме человека. Химический состав теллура поддерживает множество активностей, но его биохимия до сих пор четко не установлена. Небольшое соединение теллура ^IV , трихлор (диоксоэтилен- o, o ′) теллурат (AS101) аммония, разработанное и первоначально исследованное нами, в настоящее время проходит клинические испытания фазы II у пациентов с псориазом. AS101 – первое соединение теллура, испытанное на клиническую эффективность. Это соединение является мощным иммуномодулятором как in vitro, так и in vivo с множеством потенциальных терапевтических применений. Настоящий обзор будет сосредоточен на иммуномодулирующих свойствах AS101 и, в частности, на его влиянии на уменьшение аутоиммунных заболеваний. AS101 обладает несколькими активностями, которые действуют на иммунную систему, включая: 1) его способность снижать уровни IL-17 и ингибировать функцию клеток Th27; 2) его специфическая уникальная редокс-модулирующая активность, позволяющая ингибировать специфические интегрины лейкоцитов, такие как α4β1 и α4β7, которые имеют решающее значение для диапедеза макрофагов и CD4 ⁺ T воспалительных / аутореактивных клеток в аутоиммунные ткани; и 3) его способность усиливать активность регуляторных Т-клеток (Treg).Эти действия в сочетании с отличным профилем безопасности позволяют предположить, что AS101 может быть многообещающим кандидатом для лечения аутоиммунных заболеваний.

Сокращения

воспалительные заболевания кишечника

центральная нервная система

экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

адгезия слизистой оболочки молекула клеточной адгезии

декстран натрия сульфат09

Tellur 9000

Цитокины

IL-17

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Copyright © 2014 Elsevier B.V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

AS101 улучшает экспериментальный аутоиммунный увеит, регулируя ответы Th2 и Th27 и индуцируя Treg-клетки

Основные моменты

•

AS101 – новый нетоксичный иммуномодулятор с плейотропными эффектами.

•

AS101 стимулирует регуляторные Т-клетки in vivo и in vitro независимо от TGF-β.

•

AS101 подавляет дифференцировку эффекторных клеток Th2 и Th27.

•

Лечение AS101 ослабляет экспериментальный аутоиммунный увеит.

Реферат

AS101 – это целлюлозоорганическое соединение с многогранными иммунорегуляторными свойствами, которое отличается отсутствием токсичности. Мы протестировали терапевтический эффект AS101 при экспериментальном аутоиммунном увеите (EAU), модели аутоиммунного увеита человека. Неожиданно обработка AS101 вызвала генерацию Treg in vivo у мышей, не подвергавшихся манипуляциям.У мышей, иммунизированных против EAU ретинальным антигеном IRBP и обработанных AS101, развилось ослабленное заболевание, также как и у получавших AS101 реципиентов ретина-специфических Т-клеток, активированных in vitro . В обоих случаях количество эффекторных Т-клеток, инфильтрирующих глаз, было уменьшено, тогда как регуляторных Т (Treg) -клеток в селезенке увеличивалось. Механистические исследования in vitro показали, что AS101 ограничивает поляризацию ретина-специфических Т-клеток по отношению к клонам Th2 или Th27 путем репрессии активации их соответствующих клон-специфичных факторов транскрипции и нижестоящих сигналов. Специфические для сетчатки Т-клетки, поляризованные in vitro и по направлению к Th2 или Th27 в присутствии AS101, имели нарушенную способность индуцировать EAU у наивных реципиентов. Наконец, AS101 способствовал дифференцировке специфичных для сетчатки Т-клеток в Tregs in vitro независимо от TGF-β. Мы пришли к выводу, что AS101 модулирует аутоиммунные Т-клетки, ингибируя приобретение и экспрессию эффекторной функции и способствуя генерации Treg, и предполагаем, что AS101 может быть полезен в качестве терапевтического подхода при аутоиммунном увеите.

Ключевые слова

AS101

Регуляторные Т-клетки

Th27 клетки

Экспериментальный аутоиммунный увеит

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Опубликовано Elsevier Ltd.

0003 Рекомендуемые статьи

История развития астрономии и движения планет. Формирование солнечной системы. Солнце и его влияние на землю. Описание планет и спутников нашей Солнечной системы, включая недавние результаты космической программы. Использование обсерватории. Имеет зачетные единицы по естественным наукам (с лабораторией) в CAS. Начиная с осени 2018 года, этот курс включает в себя единый блок в каждой из следующих областей BU Hub: научное исследование I, количественное мышление I, критическое мышление.

Примечание: этот курс также предлагается во время летнего семестра

Обратите внимание, что эта информация может измениться в любое время.Посетите ссылку для студентов, чтобы получить самую последнюю информацию о курсе.

Бактерицидная активность теллурового соединения AS101 против Enterobacter cloacae | Журнал антимикробной химиотерапии

Аннотация

Цели

В этом исследовании впервые показано антибактериальное действие теллурового соединения AS101 на грамотрицательную бактерию Enterobacter cloacae .

Методы

Антимикробный эффект препарата проявлялся в ингибировании роста, в ингибировании образования биопленок и в его способности проникать в бактериальную клетку и вызывать повреждения и ультраструктурные изменения.

Результаты

AS101 оказался бактерицидным препаратом с МИК и МБК 9,4 мг / л. Он подавляет рост бактерий и вызывает снижение жизнеспособности на шесть порядков в богатой белком среде, но не в среде с более низким содержанием белка, если не добавить 2-меркаптоэтанол. Субингибирующие концентрации подавляют подвижность и образование биопленок. AS101 проникает в бактерии через свои порины и вызывает бактериальное повреждение насосов Na ⁺ / K ⁺ и утечку калия, фосфора и серы.Ультраструктурные изменения внутри бактериальной клетки и на ее поверхности демонстрируют неполную поверхность с вогнутостью в центре, которая выглядит как отверстие, из которого высвобождаются агрегаты, а также происходит лизис клеток.

Выводы

AS101 обладает антибактериальной активностью, которая может быть полезна против E. cloacae и других видов Enterobacteriaceae в качестве замены существующих антибиотиков, которые стали неэффективными из-за повышения устойчивости бактерий.

Введение

Нетоксичный иммуномодулятор трихлор (диоксиэтилен- O , O ′) теллурат аммония (AS101) представляет собой низкомолекулярное (312 Да) синтетическое теллуровое соединение. ¹ AS101 обладает иммуномодулирующими свойствами ^2–5 и, как было показано в нескольких доклинических и клинических исследованиях, оказывает положительное воздействие. Также было показано, что он обладает антибактериальной способностью в модели перевязки слепой кишки и пункции (CLP) за счет увеличения выживаемости мышей с сепсисом ⁶ и снижения смертности и количества ран в модели золотой рыбки, инфицированной бактериями Aeromonas salmonicida . и подвергался стрессу. ⁷ Приведенные выше модели предполагают косвенное действие AS101 на грамотрицательные бактерии.Эта лаборатория недавно продемонстрировала прямой антимикробный эффект AS101 на бета-лактамазу расширенного спектра (БЛРС) и не продуцирующие БЛРС штаммы Klebsiella pneumoniae . ⁸

Enterobacter cloacae составляют часть нормальной флоры желудочно-кишечного тракта 40–80% населения и широко распространены в окружающей среде. ^9,10 Как и большинство представителей семейства Enterobacteriaceae, эти микроорганизмы являются важными внутрибольничными патогенами, способными вызывать оппортунистические инфекции среди госпитализированных или ослабленных ^9,11–14 пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом. ¹⁴ E. cloacae также оказался важным патогеном, вызывающим бактериемию ^9,13–16 и инфекции высокого риска в отделениях интенсивной терапии новорожденных. ^11–13,17 В связи с увеличением числа нечувствительных к антибиотикам штаммов, действие иммуномодулятора AS101 было также исследовано на E. cloacae . В настоящем исследовании антимикробный потенциал AS101 на E. cloacae , ингибирование образования биопленок и его способность проникать в клетки E.cloacae , а также повреждения, вызванные этим соединением.

Материалы и методы

Штаммы бактерий

В данном исследовании были изучены девять клинических штаммов E. cloacae . E. cloacae штаммов были выделены в Лаборатории клинической микробиологии из гноя (четыре штамма) и из культур крови (пять штаммов) и были любезно предоставлены доктором З. Лазаровичем, руководителем лаборатории клинической микробиологии в Медицинском центре Ассаф Арофе, Зерифин. , Израиль.Штаммы были протестированы на их чувствительность к антибиотикам с помощью стандартной методики диффузии в агаре на агаре Мюллера – Хинтона (Difco, Детройт, штат Мичиган, США). Диски с антибиотиками были приобретены у Becton-Dickinson, и их содержание в микрограммах на диск, а также их символ указаны в скобках. Все девять штаммов были нечувствительны к ампициллину (AM 10), цефалотину (CF 30), цефокситину (FOX 30), эритромицину (E 15) и триметоприму / сульфаметоксазолу (SXT 25). Они были чувствительны к тетрациклину (TE 30), полимиксину B (PB 300) и аминогликозидам тобрамицину (NN 10) и амикацину (AN 30).Эти штаммы также были чувствительны к хинолонам, ципрофлоксацину (CIP 5) и офлоксацину (OFX 5).

Рост бактерий и условия лечения

Все девять штаммов выращивали в течение ночи при 37 ° C в аэробных условиях на агаре с мозгом и сердцем (BHA). Культуры переносили в жидкую среду для инфузии мозга и сердца (BHI) для получения начальной оптической плотности (OD) 0,1 при 660 нм (примерно 1,2 × 10 ⁸ КОЕ / мл). Культурам давали возможность расти дальше при перемешивании со скоростью 180 об / мин.В большинстве экспериментов обработка AS101 начиналась, когда культуры достигли ОП 0,4 при 660 нм (около 5 × 10 ⁸ КОЕ / мл). В некоторых экспериментах лекарство добавляли к бактериальным культурам в начале инкубации, когда OD составляла 0,1 при 660 нм. Рост бактерий определяли при 660 нм с помощью спектрометра Biochrom LKB (Novaspec, Кембридж, Великобритания). Жизнеспособные бактерии отслеживали и рассчитывали путем подсчета количества КОЕ после соответствующего разведения на чашках с агаром. Бактериальные культуры, выращенные в тех же условиях, но без препарата, служили контролем.

Теллурорганическое соединение AS101

AS101 (рис. 1) был предоставлен профессором М. Альбеком с кафедры химии Университета Бар-Илан, Рамат-Ган, Израиль, в виде раствора 150 мг / л в PBS при pH 7,4, и его поддерживали при 4 °. C пока не использовал.

Рисунок 1.

Химическая структура AS101.

Рисунок 1.

Химическая структура AS101.

Тест диффузии в агаре

Тест диффузии в агаре проводили с использованием метода диффузии Кирби-Бауэра. ¹⁸ Культуры E. cloacae выращивали в аэробных условиях в течение ночи при 37 ° C на чашках BHA, затем суспендировали в BHI до получения OD 0,1 при 660 нм (примерно 1,2 × 10 ⁸ КОЕ / мл) и позволяли расти при перемешивании со скоростью 180 об / мин для получения экспоненциального роста до OD 0,4 при 660 нм. Затем клетки разбавляли 1: 100 и равномерно распределяли по чашкам с агаром, содержащим указанную среду. Для тестирования антибактериальной активности 10 мкл капель AS101, содержащих конечное количество 0. 094, 0,1875, 0,375, 0,75 и 1,5 мкг / капля помещали на поверхность чашек BHA или в сравнительных тестах на питательном агаре (NA). Затем планшеты инкубировали в аэробных условиях в течение 24 ч при 37 ° C и измеряли диаметры зон ингибирования в миллиметрах.

Определения MIC и MBC

MIC AS101 определяли методом разбавления бульона. ¹⁹ Культуры E. cloacae выращивали в аэробных условиях в течение ночи на чашках BHA при 37 ° C, затем суспендировали в BHI для получения OD 0.1 при 660 нм и перемешивали при 180 об / мин для получения культур экспоненциального роста (около 5 × 10 ⁸ КОЕ / мл). Пробирки, содержащие среду BHI и 2-кратные разведения AS101 от концентрации 75 мг / л до 2,3 мг / л, инокулировали ∼10 ⁵ бактерий и инкубировали в аэробных условиях в течение 24 часов при 37 ° C. МИК определяли как самую низкую концентрацию AS101, которая предотвращала рост бактерий. МБК определяли путем отбора проб из всех пробирок без визуального помутнения по результатам теста MIC. Аликвоты 0.На планшеты BHA наносили 1 мл. MBC считался самой низкой концентрацией AS101, которая полностью подавляла рост любых КОЕ в течение 24 часов инкубации при 37 ° C. В качестве положительного контроля использовали культуру, содержащую PBS в том же объеме, что и лекарственное средство, и инокулированную тем же инокулятом клеток E. cloacae .

Исследование подвижности и способности E. cloacae образовывать биопленку

Анализы подвижности выполняли, как описано Marr et al . ²⁰ и Оверхэдж и др. . ²¹ с небольшими изменениями. Ночные культуры E. cloacae выращивали на чашках с агаром Лурия-Бертани (LB) (Difco). Одиночные колонии E. cloacae высевали в специальные чашки с плавающим, роящимся или дергающимся агаром в виде аликвот 1-2 мкл. Плавательную моторику оценивали на чашках с глюкозой BM2 +. Последняя среда содержала 62 мМ калий-фосфатный буфер при pH 7 в дополнение к 7 мМ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2 мМ MgSO ₄ , 10 мкМ FeSO ₄ и 0.4% (мас. / Об.) Глюкозы. К этой среде добавляли агар (Becton-Dickinson), 0,3% (мас. / Об.). Роевость исследовали на чашках с модифицированной глюкозой BM2 +, где 0,5% казаминокислоты заменяли 7 мМ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ . Модифицированная среда содержала 0,5% (мас. / Об.) Агара (Becton-Dickinson). Подергивание оценивали на чашках LB (Difco), содержащих 1% агара. Для обработки AS101 лекарство добавляли в среду до затвердевания во всех трех типах планшетов при конечных концентрациях 4.7 или 9,4 мг / л. Планшеты без препарата служили контролем. Планшеты инкубировали в течение 20 ч при 37 ° C, после чего измеряли плавание или роение. Подергивание измеряли через 24–48 ч инкубации при 37 ° C. ²² Все эксперименты повторяли трижды.

Формирование биопленки было обнаружено, как описано в недавней работе, ^23,24 с некоторыми модификациями. Ночные культуры разводили 1: 100 в свежей среде BHI в боросиликатных стеклянных пробирках (75 × 12 мм), которые содержали концентрации AS101, уменьшающиеся в 2 раза по сравнению с 9.От 4 мг / л (МИК) до 0,55 мг / л. Культура без AS101 служила контролем. Все культуры инкубировали при 37 ° C в течение 15 ч. Статическую биопленку выявляли, отбрасывая среду и дважды промывая пробирки бидистиллированной водой. В пробирки загружали 4 мл 1% кристаллического фиолетового на 15 мин. Краситель промывали бидистиллированной водой, и о появлении биопленки свидетельствовало наличие фиолетового кольца в пробирках.

Восстановление порообразующих белков в липосомах и анализ набухания

Белки наружных мембран E.cloacae были разделены согласно методу, описанному Tada и Yamaguchi. ²⁵ Порообразующие белки (порины) очищали методом, описанным Wexler и Getty. ²⁶ Очищенные молекулы порина были восстановлены в липосомах, которые были получены в соответствии с процедурами Nikaido и Rosenberg ²⁷ и Wexler et al . ²⁸ Анализ набухания липосом проводился, как описано Nikaido и Rosenberg ²⁷ и также был описан в нашей лаборатории. ^29–31 Набухание липосом было обнаружено с помощью сканирующего спектрометра Cary 200 в сочетании с компьютерной программой.

Рентгеновский микроанализ (XRMA)

XRMA в сочетании со сканирующей электронной микроскопией (SEM) использовали для элементного анализа отдельных клеток, содержание которых было зафиксировано глубокой заморозкой сразу после обработки. Метод был описан для бактериальных культур ранее Daniel-Hoffmann et al ., ⁸ Malik et al . ³² и Ницан и др. . ³³ Все рентгеновские спектры сняты с одинаковой скоростью счета. ³⁴

Обнаружение масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (ICPMS)

Анализ методом ICPMS, который представляет собой аналитическую атомную спектрометрию, проводили в водной гомогенной среде. Культуры E. cloacae на логарифмической фазе обрабатывали в течение 10 минут 9,4 мг / л AS101 или PBS в качестве контроля и центрифугировали в течение 5 минут при 5000 g .Супернатанты отбрасывали, а осадки обрабатывали 1 М HNO ₃ в течение 15 минут и дважды промывали. Химические элементы анализировали с помощью ICPMS (Ultima-2; Ji Jobin Yvon Horiba, Longjumeau, Франция) и рассчитывали их концентрации. Калибровочные стандарты 0,1, 1,0 и 10,0 ppm использовались для каждой серии анализов. Данные среднего и стандартного отклонения были основаны на трех повторах для каждого образца. Некоторые образцы были повторно разбавлены и проанализированы как дубликаты для обеспечения воспроизводимости. ³⁵

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Бактериальные клетки на логарифмической фазе обрабатывали 9,4 мг / л AS101 в течение 0,5 ч и обрабатывали для анализа с помощью электронной микроскопии. Осадки клеток сначала промывали 0,05 M какодилатным буфером (pH 7,2), а затем фиксировали в течение 2 часов в 0,05 M какодилат 1,5% (мас. / Об.) Глутаровым альдегидом (pH 7,2). Затем тот же буфер использовали для промывки образца в течение ночи с последующими 2 ч фиксации 2% (мас. / Об.) Тетроксидом осмия и дегидратацией этанолом.Наконец, образцы были залиты в Durcupan, и тонкие срезы были приготовлены на LKB Ultratome Nova. Срезы дважды окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. ³⁶ Образцы исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Philips CM-100.

SEM

Бактериальные клетки на логарифмической фазе обрабатывали 9,4 мг / л AS101 в течение 20 мин и обрабатывали для анализа с помощью электронной микроскопии. Осадки клеток сначала трижды промывали фосфатным буфером без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ , а затем фиксировали в течение 1 часа в 2.6% глутарового альдегида (pH 7,2) при комнатной температуре. После фиксации образцы оставляли для осаждения в течение 24 ч при 4 ° C. 100 мкл образца суспендировали на стеклянной сетке, покрытой ɛ-поли-L-лизином, в течение 1 часа, затем 1 час фиксации 2% (мас. / Об.) Тетроксидом осмия и обезвоживание этанолом и фреоном. Наконец, образцы были покрыты углеродом, и образцы были исследованы в сканирующем электронном микроскопе JSM-35C.

Статистический анализ

Представленные данные представляют собой средние значения минимум трех экспериментов для каждого штамма.Различия между бактериальными штаммами анализировали с помощью теста Стьюдента t , при этом P <0,05 считали статистически значимым.

Результаты

Антибактериальная активность AS101

На антибактериальную активность соединения теллура AS101 указывало ингибирование роста девяти изолятов E. cloacae при тестировании зоны ингибирования лекарственного средства на богатой среде (BHA).При выращивании бактерий на более бедной среде (NA) чувствительность к AS101 не проявлялась, за исключением небольшого и незначительного диаметра ингибирования (8 мм), наблюдаемого при 1,5 мкг (рис. 2). Было обнаружено, что MIC и MBC AS101 составляют 9,4 мг / л AS101 для всех девяти изолятов E. cloacae (таблица 1). Поскольку значения MIC и MBC для AS101 были одинаковыми, можно сделать вывод, что AS101 действует как бактерицидный агент для E. cloacae . Согласно определению МИК, культуры E.cloacae обрабатывали в BHI 9,4 мг / л AS101 в начале лаг-фазы и в начале лог-фазы. Такое же подавление роста было очевидным, когда AS101 был добавлен в лаг-фазе, и дальнейшего роста не наблюдалось. Когда AS101 был добавлен в логарифмической фазе (фиг. 3, верхняя панель), ингибирование начиналось сразу после добавления AS101, и наблюдалось снижение OD. Такие же результаты были получены, когда культуры (в лаг-фазе или лог-фазе) обрабатывали AS101 в питательном бульоне (NB) с добавлением 2-меркаптоэтанола (0.012 мМ).

MIC и MBC AS101 на E. cloacae

Тесты MIC и MBC AS101 на E. cloacae

Рисунок 2.

Тест диффузии в агаре E. cloacae , обработанных различными дозами AS101. Диаметр зон ингибирования измеряли, когда бактерии обрабатывали AS101 на BHA или NA.

Рисунок 2.

Испытание диффузии в агаре E. cloacae , обработанных различными дозами AS101. Диаметр зон ингибирования измеряли, когда бактерии обрабатывали AS101 на BHA или NA.

Рисунок 3.

Верхняя панель: Кривые роста E.cloacae , обработанные AS101 (9,4 мг / л) в лаг-фазе или в лог-фазе. Культуры без добавления AS101 служили контролем. Стрелки указывают на добавление AS101. Нижняя панель: Кривые жизнеспособности E. cloacae после обработки AS101 (9,4 мг / л) на логарифмической фазе. Культуры без добавления AS101 служили контролем.

Рисунок 3.

Верхняя панель: Кривые роста E. cloacae , обработанных AS101 (9,4 мг / л) в лаг-фазе или в лог-фазе.Культуры без добавления AS101 служили контролем. Стрелки указывают на добавление AS101. Нижняя панель: Кривые жизнеспособности E. cloacae после обработки AS101 (9,4 мг / л) на логарифмической фазе. Культуры без добавления AS101 служили контролем.

Кривая гибели E. cloacae , обработанных в BHI с 9,4 мг / л AS101, четко показала, что жизнеспособность снизилась более чем на два порядка в течение первых 30 минут воздействия AS101 (рис. 3, нижняя панель).Количество бактерий продолжало уменьшаться до тех пор, пока бактериальная культура полностью не уменьшилась (уменьшение более чем на восемь порядков) в течение 2 ч от начала обработки.

Влияние AS101 на подвижность и образование биопленок

Были протестированы три параметра подвижности E. cloacae : плавание, роение и подергивание. Каждый параметр измеряли в чашке особого типа и в специальной концентрации агара (см. Раздел «Материалы и методы»).На плавание в основном влияли МИК (9,4 мг / л) и 2-кратно разведенные (4,7 мг / л) концентрации AS101 по сравнению с необработанным контролем (таблица 2). Рой и подергивание также полностью подавлялись указанными выше концентрациями AS101.

(плавание, роение и подергивание) и способность образования биопленок E. cloacae до и после обработки МПК (9,4 мг / л) и снижения субингибиторных концентраций AS101

Анализы подвижности (плавание, роение и подергивание) и способность образования биопленок E. cloacae до и после обработки МПК (9.4 мг / л) и уменьшение субингибиторных концентраций AS101

Статическое образование биопленок подавлялось при концентрациях AS101 9,4 и 4,7 мг / л (таблица 2).При концентрации, которая в 4 раза ниже, чем МПК (2,35 мг / л), образование биопленок было очень слабым. При еще более низких концентрациях AS101 (1,17 и 0,58 мг / л) образование биопленок было очень значительным и было равно таковому для положительного контроля (без AS101).

Проникновение AS101 в бактериальную клетку

Вопрос о том, проникает ли соединение в клетку, был исследован, чтобы получить представление о механизме действия AS101 на бактериальные клетки E. cloacae .Проникновение AS101 было продемонстрировано с помощью анализа набухания липосом. В этом анализе молекулы порина были вставлены на поверхность липосомы. Порин, использованный для этого анализа, экспрессируется на внешней мембране штамма E. cloacae . Он был очищен, и было показано, что он представляет собой тримерный порин с молекулярной массой 120 кДа. Результаты, показанные на фиг. 4, демонстрируют, что AS101 (молекулярная масса 312 Да) проявляет способность проникать в липосомы через специфический порин E. cloacae .Арабиноза (молекулярная масса 150 Да) имела гораздо более высокую скорость проникновения, чем AS101, поскольку она имеет более низкую молекулярную массу. С другой стороны, стахиоза (MW 666 Да) не могла проникнуть в эти липосомы из-за своей высокой молекулярной массы. AS101 не может проникать в липосомы, поверхность которых не содержит поринов. То же самое было верно, когда белок BSA был включен вместо порина, то есть AS101 не проникал в липосомы. Эти результаты предполагают, что AS101 проникает в бактериальную клетку E. cloacae через порин, а не через фосфолипидную оболочку внешней мембраны, и действует внутриклеточно на жизнеспособность этой бактерии.

Рисунок 4.

Анализ набухания липосом для AS101 с использованием поринов, очищенных с внешней мембраны E. cloacae , которые были преобразованы в липосомы. Сахарная стахиоза служила отрицательным контролем, а сахарная арабиноза служила положительным контролем. БСА, восстановленный в липосомы, и невосстановленные липосомы служили контролем.

Рисунок 4.

Анализ набухания липосом для AS101 с использованием поринов, очищенных от внешней мембраны E.cloacae , которые были преобразованы в липосомы. Сахарная стахиоза служила отрицательным контролем, а сахарная арабиноза служила положительным контролем. БСА, восстановленный в липосомы, и невосстановленные липосомы служили контролем.

Обнаружение XRMA и ICPMS

Ионные потоки во время активности AS101 могут быть определены с помощью XRMA-SEM. Как видно выше, AS101 проникал через порин и проникал в периплазму и цитоплазматическую мембрану. Этот вид помех может изменить переносимость некоторых элементов в ячейку.Результаты XRMA (таблица 3) показывают, что E. cloacae , обработанные 9,4 мг / л AS101, показали увеличение притока Na и Cl, что может указывать на повреждение насосов Na ⁺ / K ⁺ , расположенных в цитоплазматическая мембрана. Наблюдалось увеличение Mg, указывающее на нарушение стабильности клеточной мембраны. С другой стороны, наблюдалось снижение уровня P, что указывает на потерю АТФ или даже повреждение ДНК.

XRMA E.cloacae после обработки AS101

XRMA E. cloacae после обработки AS101

Для подтверждения предыдущих результатов использовался метод обнаружения ICPMS. ICPMS – это метод аналитической атомной спектрометрии, который может идентифицировать большинство элементов (кроме H, N, O, C и F) и определять их концентрацию в единицах ppm (мг / л). Культуры E. cloacae обрабатывали 9,4 мг / л AS101 в течение 10 мин, а затем обрабатывали HNO ₃ , и концентрации элементов измеряли с помощью прибора для обнаружения ICPMS.Таблица 4 демонстрирует приток Na и отток K, P и даже S, где последний указывает на потерю белка из-за AS101. Необработанные клетки E. cloacae продемонстрировали более высокие количества K, P и S, в то время как количества натрия были ниже, чем в обработанных бактериальных клетках.

Потенциальная активность AS101 против E. cloacae была впервые охарактеризована несколькими методами. Обработка изолятов E. cloacae AS101 вызвала ингибирование роста бактерий на агаре, которое зависело от среды.В этом исследовании AS101 подавлял рост E. cloacae , особенно в богатой среде (BHI), и не действовал в NB, если 2-меркаптоэтанол не был добавлен с лекарством. То же явление было обнаружено у K. pneumoniae . ⁸ Кажется, что причина не только в том, что BHI содержит более высокую концентрацию белка, чем среда NB (в 15 раз), ⁴¹ , но и потому, что он содержит высокий уровень тиолов. Это результат того факта, что соединения Те (IV) легко взаимодействуют с тиолами с образованием соединений Те (тиол) 4. ⁴² Все эти открытия привели нас к предположению, что AS101 может потребовать носителя для преодоления барьеров бактериальных клеток и что он использует свободные тиолы в качестве носителя. Эти результаты показывают, что тиолы играют важную роль в механизме действия AS101 и поддерживают его клинический потенциал AS101.

МИК и МБК AS101 в богатой белком среде оказались равными 9,4 мг / л для всех девяти испытанных изолятов. Эта концентрация препарата немедленно подавляла рост бактерий, когда их лечили в лаг-фазе.Когда бактерии обрабатываются на ранней стадии логарифмической фазы, рост останавливается, и уменьшение OD наблюдается в течение 30 минут от начала лечения. Жизнеспособность также сразу же снизилась, и полное уничтожение культуры было достигнуто менее чем за 2 часа (снижение более чем на семь порядков).

Результаты, полученные в этом исследовании, показывают, что AS101 может проникать в клетки E. cloacae через внешнюю мембрану. Основная роль внешней мембраны грамотрицательных бактерий – служить барьером проницаемости для предотвращения проникновения вредных соединений и, в то же время, обеспечивать приток молекул питательных веществ ^27,43 через порообразующие белки ( порины).Проникновение AS101 через порины, которые были очищены из E. cloacae и включены в липосомы, имитируя внешнюю мембрану, привело нас к предположению о возможном механизме, посредством которого AS101 проникает в клетку E. cloacae . Пора в порине E. cloacae достаточно велика (в диаметре), чтобы позволить молекуле размером AS101 (молекулярная масса 312 Да) проникнуть через нее. Альтернативная возможность, что AS101 может проникать непосредственно во внешнюю мембрану, была исключена, поскольку AS101 не проникал в липосомы, не включенные с порином, или в липосомы, в которые был включен BSA вместо порина.Эти результаты могут быть экстраполированы на других членов семейства Enterobacteriaceae и могут быть верными для других грамотрицательных бактерий.

Одна из проблем инфекций в больницах – это способность бактерий образовывать биопленку на поверхностях, оборудовании и внутри катетеров. ^44–46 Образование биопленки внутри катетера может быть опасным для жизни, когда бактериальная масса отрывается от внутренней стенки катетера и смывается инфузионной жидкостью непосредственно в кровоток пациента, вызывая сепсис. ⁴⁴ Важным процессом в развитии биопленки является подвижность бактерий на поверхностях. ⁴⁷ В настоящем исследовании было недвусмысленно продемонстрировано, что подвижность E. cloacae подавляется после обработки AS101. Все три характерные формы подвижности, плавание через жгутики, ⁴⁷ роение через жгутики и пили ⁴⁶ и подергивание через пили ⁴⁶ , были нарушены после лечения AS101. Обесценение очевидно не только на ВПК (9.4 мг / л) препарата, но также при 2-кратной субингибирующей концентрации (4,7 мг / л) препарата против E. cloacae . Также было обнаружено, что бактерий E. cloacae не смогли сформировать биопленку даже при субингибирующей концентрации, равной половине (4,7 мг / л) МПК (9,4 мг / л) и одной четверти (2,35 мг / л). L) МПК биопленка была очень слабой. Способность AS101 подавлять факторы вирулентности для подвижности и прикрепления к поверхностям клеток или искусственных устройств (образование биопленок) очень важна, поскольку она может быть очень полезной для клинициста.Это открытие также подтверждает вышеприведенные результаты о том, что молекулы AS101 проникают через порины и действуют внутриклеточно на компоненты внутри клетки, которые ответственны за производство жгутиков и пилей.

Еще одно доказательство того, что молекулы AS101 действуют внутри клетки, было получено с помощью XRMA и ICPMS. Оба метода показали, что при проникновении в бактериальную клетку AS101 повреждает цитоплазматическую мембрану, а также связанные с ней насосы. Кажется, что AS101 может вызвать повреждение насосов Na ⁺ / K ⁺ , что вызывает утечку ионов через поврежденную мембрану.Приток Na ⁺ в клетку и утечка P или даже S четко указывают на утечку АТФ, нуклеотидов и даже белков из клеток. Клетки не могут размножаться в таких условиях, и их жизнеспособность снижается. ⁴⁸ Результаты XRMA для E. cloacae аналогичны результатам, продемонстрированным для K. pneumoniae с тем же препаратом. ⁸ Изображения ПЭМ и СЭМ подтверждают результаты, полученные с помощью XRMA и ICPMS. Пустые ячейки, видимые ПЭМ, вероятно, являются результатом утечки содержимого ячейки.В некоторых клетках видны агрегаты в хромосомной области, что может указывать на повреждение бактериальной хромосомы. Эти агрегаты были показаны в нашей предыдущей работе с обработанным AS101 K. pneumoniae . ⁸ Аналогичная картина агрегатов в хромосомной области была получена в другой работе этой лаборатории. ⁴⁸ Предполагалось, что эти агрегаты являются центрами репарации двухцепочечной ДНК посредством RecA из-за активации SOS-ответа. ⁴⁹ СЭМ продемонстрировал отверстие в центре обработанных клеток, что означает перфорацию клеточной стенки.Это также наблюдалось у обработанного AS101 K. pneumoniae . ⁸ Было замечено, что некоторые обработанные AS101 клетки E. cloacae высвобождают небольшие тела из этого отверстия. Эти маленькие тела, которые вытекают из клетки, могут быть фрагментами эндотоксина, которые, как известно, высвобождаются во время лечения антибиотиками инфекций, вызванных грамотрицательными микроорганизмами. ⁵⁰ Другая возможность заключается в том, что обработка AS101 вызывает стрессовую реакцию, которая приводит к индукции профагов внутри бактериальной клетки, и потомство высыпается через отверстие.Это подтверждается нашими наблюдениями за фаговой частицей, появляющейся из поврежденной бактериальной клетки. На сегодняшний день не было получено экспериментальных доказательств этого явления, вероятно, из-за отсутствия надлежащего размножающегося бактериального штамма, который будет показывать бляшки на чашках с агаром или лизис в жидкой среде.

Антимикробный потенциал AS101 продемонстрирован в этом исследовании на E. cloacae , другом члене семейства Enterobacteriaceae. Известно, что это семейство содержит множество патогенных видов, вызывающих тяжелые инфекции у госпитализированных пациентов, и сейчас они проходят испытания с помощью AS101.AS101 может стать потенциальной заменой или дополнением к текущему лечению антибиотиками, устойчивость которого растет.

Финансирование

Эта работа была частично поддержана кафедрой онкологических исследований д-ра Тови Комет-Валерстайн, кафедрой онкологических исследований Дейва и Флоренс Мусковиц и Мемориальным фондом рака Фриды Столлман. Это исследование также было частично поддержано Фондом микробиологии Раппапорта, Университет Бар-Илан, Израиль (Ю.Н.).

Заявления о прозрачности

Не подлежат декларированию.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить г-жу Рэйчел Дрор за ее отличную техническую помощь и полезные комментарии, д-ра Изабеллу Печатникову за помощь в анализе липосомного набухания и г-на Офира Авидана за его помощь в подготовке образцов для ТЕА, а также за полезные обсуждения и помощь.

Некоторые материалы, включенные в эту рукопись, касаются бактерии E.cloacae ранее была опубликована в следующем реферате: Hoffman-Daniel M, Albeck M, Sredni B, Nitzan Y. Бактерицидная активность соединений теллура AS 101 на Enterobacter cloacae . Ежегодное собрание Израильского общества микробиологов, Реховот, Израиль, 2008 г. P-26. п. 76.

Это исследование было проведено в рамках требований для получения докторской степени M. D.-H.

Список литературы