| Основные характеристики | – |
| Производитель | ДКС |
| Модель | 01332 |
| Тип монтажного оборудования | Кабель-канал |
| Цвет | Серый |
| Материал изделия | Пластик |
| Наименование | Напольный канал 75×17 мм CSP-F, серый |
| Степень защиты | IP40 |
| Количество отсеков | 2 |
| Напряжение пробоя, В | Более 2500 |
| Прочие характеристики | – |
| Сертификат | C-IT.ПБ25.B03637 |
| Страна | Россия |
| Ударопрочность | 4 |
| Климатическое исполнение | УХЛ4 |
| Пожаробезопасность | Не распространяет горение (по ГОСТ Р 53313-2009) |
| Размер | – |
| Длина, мм | 2000 |
| Высота, мм | 17.5 |
| Ширина, мм | 95.1 |
| Масса, кг | 0.6175 |
| ширина(см) | 20.0000 |
| manufacturerCountry | Россия |
| описание | Кабель-канал 01332 от компании DKC. |
| длина(см) | 215.0000 |
| высота(см) | 7.0000 |
| gtdNumber | — |
| масса(кг) | 0.6667 |
| id сертификата | 0 |
| rusName | [Ручной инструмент] Dkc 01332 Напольный канал 75 x 17 мм CSP-F, серый ( 2 метра) |
| инструкция | null |
| сайт производителя | http://www.dkc.ru/ru/ |
| pictureID | 312958 |
| id | 1536982 |
| гарантия | Б. Г. |
| GTIN | null |
| драйвер | null |
| название | Dkc 01332 Напольный канал 75 x 17 мм CSP-F, серый ( 2 метра) |
| partNumber | 01332 |
Зарница / Ручной инструмент Dkc 01332 Напольный канал 75 x 17 мм CSP-F, серый ( 2 метра)
Кабель-канал 01332 от компании DKC.
| Основные характеристики | – |
| Производитель | ДКС |
| Модель | 01332 |
| Тип монтажного оборудования | Кабель-канал |
| Тип серии | нет |
| Цвет | Серый |
| Материал изделия | Пластик |
| Дополнительная информация | нет |
| Наименование | Напольный канал 75×17 мм CSP-F, серый |
| Покрытие | Без покрытия |
| Степень защиты | IP40 |
| Крышка | Пластик |
| Крепление | стандартное |
| Количество отсеков | 2 |
| Заземление | нет |
| Напряжение пробоя, В | Более 2500 |
| Прочие характеристики | – |
| Сертификат | C-IT.ПБ25.B03637 |
| Страна | Россия |
| Форма | обычная |
| Не содержит галоген | Да |
| Ударопрочность | 4 |
| Климатическое исполнение | УХЛ4 |
| Пожаробезопасность | Не распространяет горение (по ГОСТ Р 53313-2009) |
| Размер | – |
| Длина, мм | 2000 |
| Высота, мм | 17.5 |
| Ширина, мм | 95.1 |
| Масса, кг | 0.6175 |
| Сайт производителя | Сайт производителя |
Вся информация (включая цены) на этом интернет-сайте носит исключительно информационный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой, определяемой положениями Статьи 437 (2) Гражданского кодекса РФ. Компания оставляет за собой право в любое время без специального уведомления вносить изменения, удалять, исправлять, дополнять, либо любым иным способом обновлять информацию, размещенную во всех разделах данного сайта. Для получения подробной информации о стоимости, сроках и условиях поставки просьба обращаться по указанным на сайте телефонам.
Напольный канал CSP-F 75х17.0мм 2-секционный, цвет серый, 01332, DKC
Напольный канал CSP-F 75х17.0мм 2-секционный, цвет серый, 01332, DKCАксессуары для напольного кабель-канала 75х17
| 05911 | Угол плоский для напольного канала 75х17мм APSP W, цвет белый RAL 9001 |
| 05912 | Угол плоский для напольного канала 75х17мм APSP G, цвет серый RAL 7030 |
| 01342 | Угол плоский для напольного канала 75х17мм APSP A, цвет черный RAL 7021 |
| 05913 | Соединение для напольного канала 75х17мм GSP W, цвет белый RAL 9001 |
| 05914 | Соединение для напольного канала 75х17мм GSP G, цвет серый RAL 7030 |
| 01344 | Соединение для напольного канала 75х17мм GSP A, цвет черный RAL 7021 |
| 05915 | Тройник для напольного канала 75х17мм DSP W, цвет белый RAL 9001 |
| 05916 | Тройник для напольного канала 75х17мм DSP G, цвет серый RAL 7030 |
| 01343 | DSP A Тройник цвет черный |
Каталог пластиковых кабель-каналов
Инструкция по установке и монтажу к кабель-каналу
Для организации открытых кабельных линий в помещениях с большой площадью рекомендовано использование напольных каналов, которые позволяют эстетично и безопасно организовать цепи, идущие к стационарному оборудованию и рабочим местам. Серый короб 75х17 позволяет избавиться от большого количества переносок, удлинителей и других типов проводов, укомплектовав их в один короб, в котором предусмотрено разделение на секции. Допускается монтаж силовых, слаботочных, телекоммуникационных кабелей.
Сфера использования:
- офисные здания, торговые центры, музеи, больницы;
- складские помещения, ангары;
- игровые залы, фабрики и производственные предприятия.
Представляет собой пластиковое изделие повышенной прочности и гибкости, что позволяет выдерживать высокую нагрузку и механические повреждения. Свойства пластика не поддерживают горение при коротком замыкании. При длительной деформации геометрия не нарушается. Состоит из двух элементов: короба, имеющего разделитель по центру и замков для крепления крышки, имеющей обтекающую форму, облегчающую проход и переезд через канал.
Напольный канал CSP-F 75х17.0мм 2-секционный, цвет серый 01332, DKC имеет ряд преимуществ:
- обтекаемость, что не создаёт дискомфорта для прохожих. Применение данного канала позволяет получить эстетичные линии электропроводки, защищённые от механических воздействий и ультрафиолета;
- специальный уплотнитель на краю крышки обеспечивает хорошую амортизацию конструкции, не допускает проникновения влаги и пыли в корпус, хорошо прижимает провода;
- серый короб 75х17 является универсальным решением для большинства коммерческих и общественных помещений, где интерьеры выполнены в нейтральных тонах.
Чтобы организовать сложные конфигурации, рекомендовано воспользоваться вспомогательными аксессуарами из линейки In-Liner.
Состав системы напольных плинтус-каналов и вариант их монтажаВидео кабель-каналы ДКС
Короба ДКС видео
Автор: МЕГА КАБЕЛЬ
- Бренд – DKC.
- Тип кабель-канала – Напольный.
- Габарит кабель канала [ШхВ] – 75х17.
- Серия – CSP.
- Артикул – 01332-dkc.
Кабель-канал напольный CSP 75х17 G серый 01332
Характеристики
Описание товара
Наличие в магазинах
Отзывы (0)
Вопрос-ответ
Цвет:
Серый
Серия:
In-liner Front
Ширина:
75
Высота:
17
Классификация:
Кабель-канал напольный
Длина:
2000
Производитель:
ДКС
Артикул:
-
01332
Вес:
0,503
Объем:
0,001
Фасовка:
16
г. Краснодар, ул Онежская, 60
В наличии16
г. Краснодар, ул. Кр. Партизан, 194
В наличии1
г. Краснодар, ул. Солнечная, 25
В наличии12
г. Анапа, ул. Парковая, 62б
Под заказ0
г. Краснодар, ул. Дзержинского, 98/3
В наличии10
г. Краснодар, ул. Уральская, 87
Под заказ
г. Краснодар, ул. Российская, 252
В наличии20
г. Краснодар Центральный склад
В наличии86
г. Краснодар, ул. Западный обход, 34
Под заказ0
Раздел не найден.
| Абакан | Республика Хакасия |
| Абинск | Краснодарский край |
| Адлер | Краснодарский край |
| Азов | Ростовская область |
| Аксай | Ростовская область |
| Александро-Невский | Рязанская область |
| Александров | Владимирская область |
| Алексеевка, Алексеевский р-он | Белгородская область |
| Алексин | Тульская область |
| Алушта | Крым |
| Альметьевск | Республика Татарстан |
| Амурск | Хабаровский край |
| Анапа | Краснодарский край |
| Ангарск | Иркутская область |
| Анжеро-Судженск | Кемеровская область |
| Анциферово | Москва |
| Апатиты | Мурманская область |
| Апрелевка | Москва |
| Апшеронск | Краснодарский край |
| Арзамас | Нижегородская область |
| Армавир | Краснодарский край |
| Арсеньев | Приморский край |
| Артем | Приморский край |
| Архангельск | Архангельская область |
| Асбест | Свердловская область |
| Асино | Томская область |
| Астрахань | Астраханская область |
| Ахтубинск | Астраханская область |
| Ачинск | Красноярский край |
| Аша | Челябинская область |
| Балабаново | Калужская область |
| Балаково | Саратовская область |
| Балахна | Нижегородская область |
| Балашиха | Москва |
| Барнаул | Алтайский край |
| Батайск | Ростовская область |
| Бахчисарай | Крым |
| Белая Калитва | Ростовская область |
| Белгород | Белгородская область |
| Белебей | Республика Башкортостан |
| Белово | Кемеровская область |
| Белоомут | Москва |
| Белорецк | Республика Башкортостан |
| Белореченск | Краснодарский край |
| Бердск | Новосибирская область |
| Березники | Пермский край |
| Березовский, гор.окр. Березовс | Свердловская область |
| Бийск | Алтайский край |
| Биробиджан | Еврейская автономная область |
| Бирск | Республика Башкортостан |
| Благовещенск | Амурская область |
| Благодарный | Ставропольский край |
| Богородицк | Тульская область |
| Бор | Нижегородская область |
| Бордуки | Москва |
| Борзя | Забайкальский край |
| Борисоглебск | Воронежская область |
| Боровичи | Новгородская область |
| Братск | Иркутская область |
| Бронницы | Москва |
| Брянск | Брянская область |
| Бугульма | Республика Татарстан |
| Буденновск | Ставропольский край |
| Бузулук | Оренбургская область |
| Бутово | Москва |
| Бутово, Москва | Москва |
| Великие Луки | Псковская область |
| Великий Новгород | Новгородская область |
| Великий Устюг | Вологодская область |
| Вельск | Архангельская область |
| Венёв | Тульская область |
| Верхняя Пышма | Свердловская область |
| Видное | Москва |
| Владивосток | Приморский край |
| Владикавказ | Республика Северная Осетия (Алания) |
| Владимир | Владимирская область |
| ВНИИССОК, Одинцовский р-н | Москва |
| Волгоград | Волгоградская область |
| Волгодонск | Ростовская область |
| Волжск, Волжский р-н | Республика Марий Эл |
| Волжский | Волгоградская область |
| Вологда | Вологодская область |
| Волоколамск | Москва |
| Волхов | Ленинградская область |
| Воробьи | Калужская область |
| Воронеж | Воронежская область |
| Воскресенск | Москва |
| Воскресенское поселение | Москва |
| Восточный мкр., округ Балашиха | Москва |
| Воткинск | Республика Удмуртия |
| Всеволожск | Ленинградская область |
| Выборг | Ленинградская область |
| Выкса | Нижегородская область |
| Вышний Волочёк, гор.окр. Вышни | Тверская область |
| Вязники | Владимирская область |
| Вязьма | Смоленская область |
| Вятские Поляны | Кировская область |
| Галич | Костромская область |
| Гатчина | Ленинградская область |
| Геленджик | Краснодарский край |
| Георгиевск | Ставропольский край |
| Глазов | Республика Удмуртия |
| Голицыно | Москва |
| Горелово | Санкт-Петербург |
| Горно-Алтайск | Республика Алтай |
| Городец | Нижегородская область |
| Горячий Ключ | Краснодарский край |
| Грозный | Республика Чечня |
| Грязи | Липецкая область |
| Губаха | Пермский край |
| Губкин | Белгородская область |
| Губкинский | Ямало-Ненецкий автономный округ |
| Гуково | Ростовская область |
| Гусь-Железный | Рязанская область |
| Гусь-Хрустальный | Владимирская область |
| Данков | Липецкая область |
| Десеновское | Москва |
| Джанкой | Крым |
| Дзержинск, Нижегородская | Нижегородская область |
| Дзержинск, Нижегородская обл. | Нижегородская область |
| Дзержинский | Москва |
| Димитровград | Ульяновская область |
| Динская | Краснодарский край |
| Дмитриевка | Тамбовская область |
| Дмитров | Москва |
| Доброе | Липецкая область |
| Долгопрудный | Москва |
| Домодедово | Москва |
| Донецк | Ростовская область |
| Донино | Москва |
| Донской | Тульская область |
| Дрожжино, Ленинский р-н | Москва |
| Дубна | Москва |
| Евпатория | Крым |
| Егорьевск | Москва |
| Ейск | Краснодарский край |
| Екатеринбург | Свердловская область |
| Елабуга | Республика Татарстан |
| Елатьма | Рязанская область |
| Елец | Липецкая область |
| Елизово | Камчатский край |
| Ермишь | Рязанская область |
| Ессентуки | Ставропольский край |
| Ефремов | Тульская область |
| Железноводск | Ставропольский край |
| Железногорск, Красноярский кра | Красноярский край |
| Железногорск, Курская обл. | Курская область |
| Железнодорожный, округ Ба | Москва |
| Железнодорожный, округ Балаших | Москва |
| Железнодорожный, округ Балаших | Москва |
| Жуковский | Москва |
| Забайкальск | Забайкальский край |
| Заводоуковск | Тюменская область |
| Заволжье | Нижегородская область |
| Задонск | Липецкая область |
| Заинск | Республика Татарстан |
| Зарайск | Москва |
| Заречный | Свердловская область |
| Заринск | Алтайский край |
| Захарово | Рязанская область |
| Звенигород | Москва |
| Зеленогорск | Красноярский край |
| Зеленоград | Москва |
| Зеленодольск | Республика Татарстан |
| Зеленокумск | Ставропольский край |
| Зерноград | Ростовская область |
| Златоуст | Челябинская область |
| Знаменка | Тамбовская область |
| Ивангород, Кингисеппский р-н | Ленинградская область |
| Иваново | Ивановская область |
| Ивантеевка | Москва |
| Игра | Республика Удмуртия |
| Ижевск | Республика Удмуртия |
| Изобильный | Ставропольский край |
| Иловай-Дмитриевское | Тамбовская область |
| Иноземцево | Ставропольский край |
| Ирбит | Свердловская область |
| Иркутск | Иркутская область |
| Искитим | Новосибирская область |
| Истра | Москва |
| Ишим | Тюменская область |
| Йошкар-Ола | Республика Марий Эл |
| Кадом | Рязанская область |
| Казань | Республика Татарстан |
| Калининград | Калининградская область |
| Калуга | Калужская область |
| Каменск-Уральский | Свердловская область |
| Каменск-Шахтинский | Ростовская область |
| Камышин | Волгоградская область |
| Камышлов | Свердловская область |
| Канаш | Чувашская Республика |
| Канск | Красноярский край |
| Касимов | Рязанская область |
| Качканар | Свердловская область |
| Кашира | Москва |
| Кемерово | Кемеровская область |
| Керчь | Крым |
| Кизляр, Дагестан респ. | Республика Дагестан |
| Кимовск | Тульская область |
| Кимры | Тверская область |
| Кингисепп | Ленинградская область |
| Кинешма | Ивановская область |
| Киржач | Владимирская область |
| Кирицы | Рязанская область |
| Кириши | Ленинградская область |
| Киров | Кировская область |
| Киров, Кировская обл. | Кировская область |
| Кировск, Ленинградская обл. | Ленинградская область |
| Киселёвск | Кемеровская область |
| Кисловодск | Ставропольский край |
| Климовск | Москва |
| Клин | Москва |
| Клинцы | Брянская область |
| Ковров | Владимирская область |
| Когалым | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Коломна | Москва |
| Колпино | Санкт-Петербург |
| Кольцово | Новосибирская область |
| Кольчугино | Владимирская область |
| Коммунарка | Москва |
| Комсомольск-на-Амуре | Хабаровский край |
| Конаково | Тверская область |
| Копейск | Челябинская область |
| Кораблино | Рязанская область |
| Королев | Москва |
| Коротчаево | Ямало-Ненецкий автономный округ |
| Кострома | Костромская область |
| Котельники | Москва |
| Котельнич | Кировская область |
| Котлас | Архангельская область |
| Котовск | Тамбовская область |
| Красная Поляна | Краснодарский край |
| Красноармейск | Москва |
| Красногорск | Москва |
| Красногорск, Павшинская Пойма | Москва |
| Краснодар | Краснодарский край |
| Красное Село | Санкт-Петербург |
| Краснокамск | Пермский край |
| Краснообск | Новосибирская область |
| Красноперекопск | Крым |
| Краснотурьинск | Свердловская область |
| Красноуфимск | Свердловская область |
| Красноярск | Красноярский край |
| Кронштадт | Санкт-Петербург |
| Кропоткин | Краснодарский край |
| Крымск | Краснодарский край |
| Кстово | Нижегородская область |
| Кубинка | Москва |
| Кудымкар | Пермский край |
| Кунгур | Пермский край |
| Курган | Курганская область |
| Курганинск | Краснодарский край |
| Куровское | Москва |
| Курск | Курская область |
| Курчатов | Курская область |
| Кутуково | Рязанская область |
| Кыштым | Челябинская область |
| Лабинск | Краснодарский край |
| Лангепас | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Лебедянь | Липецкая область |
| Лев Толстой | Липецкая область |
| Ленинградская | Краснодарский край |
| Лениногорск | Республика Татарстан |
| Ленинск-Кузнецкий | Кемеровская область |
| Лермонтов | Ставропольский край |
| Лесной | Свердловская область |
| Лесосибирск | Красноярский край |
| Ликино-Дулево | Москва |
| Липецк | Липецкая область |
| Лиски, Лискинский р-н | Воронежская область |
| Лобня | Москва |
| Луга | Ленинградская область |
| Луховицы | Москва |
| Лыткарино | Москва |
| Люберцы | Москва |
| Людиново | Калужская область |
| Магадан | Магаданская область |
| Магнитогорск | Челябинская область |
| Майкоп | Республика Адыгея |
| Малаховка | Москва |
| Малоярославец | Калужская область |
| Маркс | Саратовская область |
| Махачкала | Республика Дагестан |
| Мегион | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Междуреченск | Кемеровская область |
| Мелеуз | Республика Башкортостан |
| Миасс | Челябинская область |
| Миллерово, Миллеровский р-н | Ростовская область |
| Милославское | Рязанская область |
| Минеральные Воды | Ставропольский край |
| Минусинск | Красноярский край |
| Мирный | Республика Саха (Якутия) |
| Митино | Москва |
| Михайлов | Рязанская область |
| Михайловка | Волгоградская область |
| Михайловск | Ставропольский край |
| Мичуринск | Тамбовская область |
| Можайск | Москва |
| Монино | Москва |
| Мончегорск | Мурманская область |
| Моршанск | Тамбовская область |
| Москва | Москва |
| Московский | Москва |
| Мосрентген, Москва | Москва |
| Мурино, Всеволожский р-н | Ленинградская область |
| Мурманск | Мурманская область |
| Муром | Владимирская область |
| Мытищи | Москва |
| Набережные Челны | Республика Татарстан |
| Надым | Ямало-Ненецкий автономный округ |
| Назарово | Красноярский край |
| Назрань | Республика Ингушетия |
| Нальчик | Республика Кабардино-Балкария |
| Наро-Фоминск | Москва |
| Нарьян-Мар | Ненецкий автономный округ |
| Нахабино | Москва |
| Находка | Приморский край |
| Невинномысск | Ставропольский край |
| Невьянск | Свердловская область |
| Некрасовка | Москва |
| Нерюнгри | Республика Саха (Якутия) |
| Нефтекамск | Республика Башкортостан |
| Нефтеюганск | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Нижневартовск | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Нижнекамск | Республика Татарстан |
| Нижний Новгород | Нижегородская область |
| Нижний Тагил | Свердловская область |
| Нижняя Тура | Свердловская область |
| Ново-Переделкино | Москва |
| Новоалександровск | Ставропольский край |
| Новоалтайск | Алтайский край |
| Новокузнецк | Кемеровская область |
| Новокуйбышевск | Самарская область |
| Новомичуринск | Рязанская область |
| Новомосковск | Тульская область |
| Новороссийск | Краснодарский край |
| Новосибирск | Новосибирская область |
| Новотроицк | Оренбургская область |
| Новоуральск | Свердловская область |
| Новочебоксарск | Чувашская Республика |
| Новочеркасск | Ростовская область |
| Новошахтинск | Ростовская область |
| Новоюрьево | Тамбовская область |
| Новый Уренгой | Ямало-Ненецкий автономный округ |
| Ногинск | Москва |
| Норильск | Красноярский край |
| Ноябрьск | Ямало-Ненецкий автономный округ |
| Нягань | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Обнинск | Калужская область |
| Обухово, Ногинский р-н | Москва |
| Одинцово | Москва |
| Озерск | Челябинская область |
| Озеры | Москва |
| Октябрьский, Башкортостан | Республика Башкортостан |
| Октябрьский, Башкортостан респ | Республика Башкортостан |
| Омск | Омская область |
| Орел | Орловская область |
| Оренбург | Оренбургская область |
| Орехово-Зуево | Москва |
| Орск | Оренбургская область |
| Островцы | Москва |
| Острогожск, Острогожский р-н | Воронежская область |
| Отрадный | Самарская область |
| п.Лесной | Рязанская область |
| п.Первомайский | Тамбовская область |
| Павлово | Нижегородская область |
| Павловский Посад | Москва |
| Пенза | Пензенская область |
| Первоуральск | Свердловская область |
| Пермь | Пермский край |
| Петергоф (Петродворец) | Санкт-Петербург |
| Петрозаводск | Республика Карелия |
| Петропавловск-Камчатский | Камчатский край |
| Пителино | Рязанская область |
| Пограничный | Приморский край |
| Подольск | Москва |
| Покров | Владимирская область |
| Покровка | Приморский край |
| Полевской | Свердловская область |
| Похвистнево | Самарская область |
| Приморско-Ахтарск | Краснодарский край |
| Приозерск | Ленинградская область |
| Прокопьевск | Кемеровская область |
| Пронск | Рязанская область |
| Протвино | Москва |
| Псков | Псковская область |
| Путилково | Москва |
| Путятино | Рязанская область |
| Пушкин | Санкт-Петербург |
| Пушкино | Москва |
| Пятигорск | Ставропольский край |
| Раменское | Москва |
| Рассказово | Тамбовская область |
| Ревда | Свердловская область |
| Реутов | Москва |
| Ржакса | Тамбовская область |
| Ржев | Тверская область |
| Рогово | Москва |
| Рославль | Смоленская область |
| Россошь | Воронежская область |
| Ростов-на-Дону | Ростовская область |
| Рошаль | Москва |
| Рубцовск | Алтайский край |
| Руза | Москва |
| Рузаевка | Республика Мордовия |
| Рыбинск | Ярославская область |
| Ряжск | Рязанская область |
| Рязань | Рязанская область |
| с.Илькино | Рязанская область |
| с.Петровское | Липецкая область |
| Саки | Крым |
| Салават | Республика Башкортостан |
| Салехард | Ямало-Ненецкий автономный округ |
| Сальск | Ростовская область |
| Самара | Самарская область |
| Санкт-Петербург | Санкт-Петербург |
| Сапожок | Рязанская область |
| Сараи | Рязанская область |
| Саранск | Республика Мордовия |
| Сарапул | Республика Удмуртия |
| Саратов | Саратовская область |
| Саров | Нижегородская область |
| Сасово | Рязанская область |
| Саяногорск | Республика Хакасия |
| Светлоград | Ставропольский край |
| Северный (Москва) | Москва |
| Северный, Белгородский р-н | Белгородская область |
| Северодвинск | Архангельская область |
| Североуральск | Свердловская область |
| Северск | Томская область |
| Северская | Краснодарский край |
| Сергиев Посад | Москва |
| Серебряные Пруды | Москва |
| Серов | Свердловская область |
| Серпухов | Москва |
| Сертолово, Всеволожский р-н | Ленинградская область |
| Сестрорецк | Санкт-Петербург |
| Симферополь | Крым |
| Сколково, Мос. обл. | Москва |
| Скопин | Рязанская область |
| Славянск-на-Кубани | Краснодарский край |
| Смоленск | Смоленская область |
| Снежинск | Челябинская область |
| Советский | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Соликамск | Пермский край |
| Солнечногорск | Москва |
| Солнцево | Москва |
| Сосновый Бор | Ленинградская область |
| Софрино | Москва |
| Сочи | Краснодарский край |
| Спас-Клепики | Рязанская область |
| Спасск | Рязанская область |
| Ставрополь | Ставропольский край |
| Старая Купавна | Москва |
| Старожилово | Рязанская область |
| Староюрьево | Тамбовская область |
| Старый Оскол | Белгородская область |
| Стерлитамак | Республика Башкортостан |
| Стрежевой | Томская область |
| Строитель | Тамбовская область |
| Ступино | Москва |
| Судак | Крым |
| Сургут | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Сухой Лог | Свердловская область |
| Сходня | Москва |
| Сызрань | Самарская область |
| Сыктывкар | Республика Коми |
| Сысерть | Свердловская область |
| Тавда | Свердловская область |
| Таганрог | Ростовская область |
| Тайшет | Иркутская область |
| Талнах | Красноярский край |
| Тамбов | Тамбовская область |
| Тарасково, Наро-Фоминский р-н | Москва |
| Тверь | Тверская область |
| Темрюк | Краснодарский край |
| Тимашевск, Тимашевский р-н | Краснодарский край |
| Тихвин | Ленинградская область |
| Тихорецк | Краснодарский край |
| Тобольск | Тюменская область |
| Тольятти | Самарская область |
| Томилино | Москва |
| Томск | Томская область |
| Торжок | Тверская область |
| Тосно | Ленинградская область |
| Трехгорный | Челябинская область |
| Троица | Рязанская область |
| Троицк | Москва |
| Троицк, Москов. обл. | Москва |
| Троицк, Чел. обл | Челябинская область |
| Туапсе | Краснодарский край |
| Туймазы | Республика Башкортостан |
| Тула | Тульская область |
| Тума | Рязанская область |
| Тюмень | Тюменская область |
| Уварово | Тамбовская область |
| Узловая | Тульская область |
| Улан-Удэ | Республика Бурятия |
| Ульяновск | Ульяновская область |
| Урай | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Урюпинск | Волгоградская область |
| Усмань | Липецкая область |
| Усолье-Сибирское | Иркутская область |
| Успенское | Москва |
| Уссурийск | Приморский край |
| Усть-Лабинск | Краснодарский край |
| Уфа | Республика Башкортостан |
| Ухолово | Рязанская область |
| Ухта | Республика Коми |
| Учалы | Республика Башкортостан |
| Фащёвка | Липецкая область |
| Феодосия | Крым |
| Фролово | Волгоградская область |
| Фрязино | Москва |
| Хабаровск | Хабаровский край |
| Ханты-Мансийск | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Хатунь | Москва |
| Химки | Москва |
| Химки Новые | Москва |
| Хоботово | Тамбовская область |
| Хотьково, Сергиево-Посадский р | Москва |
| Цимлянск | Ростовская область |
| Чайковский | Пермский край |
| Чаплыгин | Липецкая область |
| Чебаркуль | Челябинская область |
| Чебоксары | Чувашская Республика |
| Челябинск | Челябинская область |
| Череповец | Вологодская область |
| Черкесск | Республика Карачаево-Черкессия |
| Черноголовка | Москва |
| Черногорск | Республика Хакасия |
| Черноморское | Крым |
| Чернушка | Пермский край |
| Чехов | Москва |
| Чистополь | Республика Татарстан |
| Чита | Забайкальский край |
| Чусовой | Пермский край |
| Чучково | Рязанская область |
| Шадринск | Курганская область |
| Шарыпово | Красноярский край |
| Шатура | Москва |
| Шаховская, Шаховской р-н | Москва |
| Шахты | Ростовская область |
| Шацк | Рязанская область |
| Шилово | Рязанская область |
| Шушары | Санкт-Петербург |
| Шуя | Ивановская область |
| Щекино | Тульская область |
| Щелково | Москва |
| Щербинка | Москва |
| Электрогорск | Москва |
| Электросталь | Москва |
| Электроугли | Москва |
| Элиста | Республика Калмыкия |
| Энгельс | Саратовская область |
| Юбилейный | Москва |
| Югорск | Ханты-Мансийский автономный округ |
| Южно-Сахалинск | Сахалинская область |
| Южноуральск | Челябинская область |
| Юрга | Кемеровская область |
| Юрюзань | Челябинская область |
| Яблоновский | Республика Адыгея |
| Якутск | Республика Саха (Якутия) |
| Ялта | Крым |
| Ялуторовск | Тюменская область |
| Янино-1, Всеволожский р-он | Ленинградская область |
| Ярославль | Ярославская область |
| Ярцево | Смоленская область |
Herschel Backpacks co Повседневные рюкзаки
Ваша конфиденциальность Строго необходимые файлы cookie Функциональные файлы cookie Файлы cookie для отслеживания и производительности Целевые и рекламные файлы cookie Больше информации
Ваша конфиденциальность важна для нас
Файлы cookie – это очень маленькие текстовые файлы, которые сохраняются на вашем компьютере, когда вы посещаете веб-сайт. Мы используем файлы cookie для различных целей и для улучшения вашего онлайн-опыта на нашем веб-сайте (например, чтобы запомнить данные для входа в вашу учетную запись).
Вы можете изменить свои предпочтения и отказаться от сохранения определенных типов файлов cookie на вашем компьютере во время просмотра нашего веб-сайта. Вы также можете удалить любые файлы cookie, уже хранящиеся на вашем компьютере, но имейте в виду, что удаление файлов cookie может помешать вам использовать некоторые части нашего веб-сайта.
Файлы cookie для отслеживания и производительности
Эти файлы cookie используются для сбора информации для анализа посещаемости нашего веб-сайта и того, как посетители используют наш веб-сайт.
Например, эти файлы cookie могут отслеживать такие вещи, как время, которое вы проводите на веб-сайте или посещаемые вами страницы, что помогает нам понять, как мы можем улучшить наш веб-сайт для вас.
Информация, собранная с помощью этих файлов cookie для отслеживания и производительности, не идентифицирует отдельного посетителя.
Целевые и рекламные файлы cookie
Эти файлы cookie используются для показа рекламы, которая может быть интересна вам в зависимости от ваших привычек просмотра.
Эти файлы cookie, обслуживаемые нашими поставщиками контента и / или рекламы, могут объединять информацию, собранную ими с нашего веб-сайта, с другой информацией, которую они независимо собирали относительно действий вашего веб-браузера в их сети веб-сайтов.
Если вы решите удалить или отключить эти целевые или рекламные файлы cookie, вы все равно будете видеть рекламные объявления, но они могут не иметь отношения к вам.
НеактивныйДополнительная информация
По любым вопросам, касающимся нашей политики в отношении файлов cookie и вашего выбора, см. Нашу Политику использования файлов cookie.
Часть работы, которую мы проделали …..
ПРЕДЫДУЩАЯ СТРАНИЦА << 1-2-3-4-5 >> СЛЕДУЮЩАЯ СТРАНИЦА | МенюПОДПИСАТЬСЯ НА НАС…..покрыты все области Великобритании и все бизнес-секторы Веб-дизайн Дерби, Ноттингем, Бертон-он-Трент, Лестер, Мидлендс и Великобритания |
JCM | Бесплатный полнотекстовый | Фармакокинетика всего тела и физиологическая модель фармакокинетики для монометилауристатина E (MMAE)
1.Введение
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) стали многообещающим классом молекул лекарств для лечения рака. Девять ADC одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, и более 80 ADC проходят клинические испытания [1]. Монометилауристатин E (MMAE) является одной из наиболее часто используемых полезных нагрузок для создания ADC, а также Adcetris ® (брентуксимаб ведотин), Padcev ® (энфортумаб ведотин-ejfv) и Polivy ®-p- (полатинузумаб). три клинически одобренных ADC, содержащих MMAE [2].После интернализации ADC высвободившийся MMAE в опухолевых клетках может проникать в окружающие клетки и вызывать убийство сторонних наблюдателей [3]. Это преимущество MMAE приводит к эффективному уничтожению опухолевых клеток. Однако он также может вызывать токсичность для здоровых клеток. Хотя MMAE-конъюгированные ADC эффективны, постоянно сообщается о гематологических побочных реакциях, таких как нейтропения (≈21%) и тромбоцитопения (≈10%) [4,5]. Более того, периферическая нейропатия (≈44%) также является преобладающим побочным эффектом в клинике (≈44%) [5,6].Обычно считается, что эта токсичность связана с фармакологическими эффектами полезной нагрузки. Однако в ограниченных исследованиях изучалась фармакокинетика (ФК) MMAE на всем теле. Хотя невозможно провести такие исследования на людях из-за присущей MMAE токсичности, необходимы доклинические исследования, изучающие PK всего тела MMAE, чтобы лучше понять расположение этой молекулы и облегчить преклинический перевод воздействия на клинический. отношения отклика, разработанные для АЦП, сопряженных с MMAE.Системные фармакокинетические свойства MMAE, такие как путь элиминации, были зарегистрированы на основании исследований фармакокинетики брентуксимаб ведотина [5,7] и MMAE [8]. Выведение MMAE происходит преимущественно через метаболический путь, опосредованный CYP3A4 / 5, и экскрецию с желчью / калом, с ограниченной почечной экскрецией [4,5,9]. Механизм действия MMAE известен, поскольку он ингибирует деление клеток за счет связывания с димерами тубулина и разрушения сети микротрубочек [4]. Связывание MMAE с его клеточной мишенью, тубулином, может привести к обширному и продолжительному воздействию лекарственного средства на ткани, и, таким образом, воздействие только плазмы может не отражать воздействие на ткани.Распределение MMAE в тканях было изучено на крысах с помощью радиоактивного исследования [8] и количественного авторадиографического исследования всего тела [7]. Yip et al. [8] изучали распределение и баланс массы MMAE после внутривенного введения 3H-меченного MMAE в дозе 200 мкг / кг. Измерение радиоактивности тканей показало быстрое распределение MMAE в органах с высокой перфузией, таких как печень, легкие и почки. Пастусковас и др. [7] охарактеризовали тканевое распределение Герцептина-vc- [ 14 C] MMAE после внутривенного введения (11 мг / кг) радиоактивно меченного ADC у крыс, которое было проанализировано с помощью количественной авторадиографии всего тела.Исследование показало, что Герцептин-vc- [ 14 C] MMAE распределяется в органы с высокой перфузией, и большая часть радиоактивности крови представлена радиоактивно меченными ADC с низкими уровнями свободного лекарственного средства. Однако в обоих исследованиях описан только характер распределения MMAE в тканях, а подробная и количественная информация о профилях концентрации и параметрах PK (то есть площади под кривой концентрации, AUC) в тканях не представлена. Следовательно, существует потребность в более тщательных количественных исследованиях, которые изучают распределение MMAE в организме.Также были проведены исследования, в которых используется математическое моделирование для характеристики системной PK MMAE-конъюгированных АЦП. Chen et al. построили минимальную физиологически обоснованную фармакокинетическую модель (PBPK) для прогнозирования межлекарственных взаимодействий для MMAE-конъюгированных ADC у людей [9]. Популяционный подход моделирования PK также использовался для исследования вариабельности PK брентуксимаб ведотина у взрослых [10] и педиатров [11]. Однако эти модели не служили цели прогнозирования распределения MMAE по всему телу.С другой стороны, vc-расщепляемый линкер обычно используется для MMAE-конъюгированных ADC, который отличается от нерасщепляемого линкера, используемого в Ado-trastuzumab emtansine (T-DM1) [12]. Как только MMAE-конъюгированный ADC интернализуется, vc-линкер может быть расщеплен протеазой в лизосоме, и свободный MMAE высвобождается в системный кровоток. Таким образом, PK неконъюгированного MMAE ведет себя так же, как MMAE, администрируемый в свободной форме. Следовательно, разработка модели PBPK для свободного MMAE может быть полезной для характеристики PK неконъюгированных MMAE после введения MMAE-конъюгированных ADC, а также для развития отношений «воздействие-реакция» для прогнозирования токсичности этих ADC.В этой рукописи мы исследовали биораспределение MMAE по всему телу у мышей с опухолями и разработали модель PBPK для характеристики плазмы, тканей и ПК опухоли MMAE. Модель PBPK для MMAE, разработанная здесь, может в дальнейшем служить основой для разработки модели платформы PBPK для MMAE-конъюгированных АЦП [13].2. Материалы и методы
2.1. Chemical and Reagents
MMAE (чистота> 98%) и D8-MMAE (внутренний стандарт (IS), чистота> 99%) были приобретены в MedChem Express (Monmouth Junction, NJ, USA).Ацетонитрил, диметилсульфоксид, буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) и ингибитор протеазы 1X Halt ™ были приобретены у Fisher Scientific (Watham, MA, США). Муравьиная кислота была приобретена у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). В данном исследовании использовалась сверхчистая вода, очищенная с помощью системы Barnstead Nanopure Diamond (Дубьюк, ИА, США)
2.2. Разработка модели мыши с ксенотрансплантатом
Линия клеток рака молочной железы MDA-MB-468 (ATCC ® HTB-132), приобретенная в American Type Tissue Culture (Манассас, штат Вирджиния, США), была использована для развития опухолей ксенотрансплантата.Клетки выращивали в среде RPMI1640 (ATCC ® 302001 ™) с добавлением инактивированной нагреванием 10% об. / Мас. Фетальной бычьей сыворотки (Gibco / Thermo Fisher Scientific, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) и 10 мкг / мл гентамицина ( Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США). Клетки культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом при 37 ° C.
Самцов бестимусных голых мышей приобретали в возрасте 6 недель в компании Charles River (Уилмингтон, Северная Каролина, США). После акклиматизации к новым условиям в течение двух недель мышам подкожно вводили MDA-MB-468 (около 10 миллионов опухолевых клеток) в правый задний бок.Исследование in vivo проводилось в соответствии с Принципами ухода за лабораторными животными (публикация 85–23 Национального института здравоохранения, пересмотренная в 1985 г.) и было одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Университета Буффало (IACUC # PHC29035Y).
2.3. Исследование биораспределения
Всего для исследований биораспределения использовали 18 мышей (возраст 6 недель, 26–35 г) с ксенотрансплантатами MDA-MB-468. Затем 0,1 мг / кг MMAE вводили мышам через вену полового члена, и конечные образцы собирали через 5 минут и 1, 6, 12, 24 и 168 часов.В каждый момент времени забивали трех мышей. Были взяты цельная кровь, ткань и опухоль. Собранные ткани включали сердце, печень, легкие, селезенку, поджелудочную железу, почки, кожу, кости, мышцы, жир и мозг. Образцы цельной крови в пробирках, предварительно покрытых этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), центрифугировали при 2000 × g в течение 20 мин при 4 ° C, а плазму собирали и хранили при -20 ° C для дальнейшего анализа. Собранные образцы тканей промокали насухо и немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до гомогенизации.
2.4. Подготовка образцов и количественное определение MMAE
методом ЖХ-МС / МС. Подробная процедура гомогенизации тканей описывалась ранее [14]. Вкратце, различные объемы буфера RIPA, содержащего ингибитор протеазы, добавляли к взвешенным образцам ткани для получения различных факторов разведения в каждой ткани. Фактор разведения составлял 5 для сердца, печени, легких, селезенки, поджелудочной железы, почек, кожи и жира, 8 для костей и мышц и 4 для образцов мозга. Образцы тканей гомогенизировали с использованием гомогенизатора для микропробирок BeadBug ™ (Benchmark, США) при максимальной скорости в течение 15 с с последующим охлаждением льдом в течение 30 с и повторяли три раза.Образцы крови без разбавления непосредственно гомогенизировали в течение 30 с при максимальной скорости и обрабатывали так же, как образцы тканей.Затем 500 мкл ацетонитрила, содержащего 0,1% муравьиной кислоты, добавляли в 100 мкл образцов гомогената плазмы, ткани или опухоли, а затем добавляли 20 мкл раствора IS (D8-MMAE 150 нг / мл). После встряхивания и центрифугирования при 15000 × g в течение 15 минут при 4 ° C супернатанты переносили в стеклянные пробирки и сушили в токе азота при 32 ° C. Высушенные остатки восстанавливали 60 мкл ацетонитрила / воды (95: 5 об. / Об.), Содержащих 0.1% муравьиной кислоты, осторожно встряхивают и сразу же переносят во флаконы для ВЭЖХ.
Стандарты и образцы контроля качества (КК) были подготовлены для плазмы и каждой тканевой матрицы. Затем в 250 мкл контрольной плазмы или матриц добавляли 20 мкл раствора IS (D8-MMAE 150 нг / мл) и 10 мкл исходного раствора MMAE, разбавленного ацетонитрилом, а затем 500 мкл ацетонитрила, содержащего 0,1% муравьиной кислоты. был добавлен. Конечные концентрации стандарта составляли 0,5, 1, 10, 100, 200 и 500 нг / мл. Контрольные образцы готовили аналогично для конечных концентраций 5, 50 и 250 нг / мкл.
Использовали систему Waters Acquity LC-MS / MS с электрораспылительным межфазным и тройным квадрупольным масс-спектрометром. Колонку ACQUITY UPLC BEH Amide (Waters, Milford, MA, USA) использовали с 5 мМ формиатом аммония и 0,1% муравьиной кислоты в качестве водной фазы, а в качестве органической фазы использовали 0,1% муравьиной кислоты и 1 мМ формиат аммония. Скорость градиентного потока составляла 0,25 мл / мин. Нижний предел количественного определения MMAE составлял 0,2 нг / мл (или нг / г) для плазмы, крови, тканей и опухоли.
2.5. Анализ данных
Некомпартментный анализ (NCA) был проведен для данных PK плазмы. AUC, рассчитанная от момента времени 0 до времени последней наблюдаемой концентрации (AUC 0-t ), была рассчитана с использованием метода линейных / логарифмических трапеций в WinNonlin (версия 8.1, Pharsight, Сент-Луис, Миссури, США). Отношения крови к плазме (KP, BC) и коэффициенты распределения ткани (KP, i) рассчитывали с использованием уравнения (1), используя значения AUCKP, BC или KP, i = AUCi, 0 − tAUCp, 0 − t,
(1)
Выше AUCi, 0-t представляет собой AUC0-t в клетке крови, опухоли или ткани i; AUCp, 0 − t – это AUC0 − t в плазме.Предполагалось, что MMAE находится в основном в клеточном компартменте тканей, и, следовательно, значение KP, i для каждой ткани было скорректировано путем деления KP, i на фракционный объем клеточного пространства каждой ткани для целей моделирования PBPK.
2.6. Разработка модели ПБПК
2.6.1. Структура модели
На рисунке 1a показана предлагаемая структура модели PBPK для MMAE. Модель PBPK включала 16 тканей и опухолевый компартмент, и все они были связаны кровотоком и расположены анатомически.Компартменты ткани включали кровь, легкие, сердце, почки, мышцы, кожу, печень, мозг, жировую ткань, тимус, кости, тонкий кишечник, толстую кишку, селезенку, поджелудочную железу и другие (т. Е. Тушу). Все остальные ткани, кроме упомянутых, были сосредоточены в «другом» отсеке. Артериальная кровь к каждому органу доставлялась эфферентной кровью, поступающей из легкого, которая перфузировалась к каждому органу и затем сходилась в компартмент крови, который представляет собой венозный бассейн. Венозная кровь, возвращенная из тонкой кишки, толстой кишки, селезенки и поджелудочной железы, доставлялась в печень.Что касается кишечника, селезенки и поджелудочной железы, кровь доставлялась в печень через печеночную воротную вену и смешивалась с кровью печеночной артерии после выхода из тканей. Доставка крови из кровеносного компартмента в легкое завершает циркуляцию кровотока. Основываясь на данных in vitro, доклинических и клинических исследований, предполагается, что выведение MMAE происходит преимущественно через метаболический путь, опосредованный CYP3A4 / 5, и экскрецию с желчью / калом [4,5,9]. Ограниченная почечная экскреция (4,5,7). Поэтому мы предположили, что MMAE выводится исключительно через печеночный клиренс (CL) из интерстициального пространства печени.Каждый тканевый компартмент был дополнительно разделен на сосудистый, эндотелиальный, интерстициальный и клеточный субкомпартменты, а сосудистое пространство было разделено на плазму и клетки крови, как показано на рисунке 1b. Мы стремились сделать субкомпартмент таким же, как наша ранее опубликованная модель PBPK антитела платформы, и, таким образом, можно легко соединить MMAE и модель PBPK антитела для построения модели ADC PBPK [13]. Предполагалось быстрое распределение MMAE между плазмой, эндотелиальными клетками и интерстициальным пространством, и, таким образом, скорость распределения между этими компартментами была установлена как значение, в 1000 раз превышающее значение кровотока в каждой ткани.Профили накопления лекарственного средства в тканях предполагают, что распределение MMAE между плазмой и клетками крови, а также между интерстициальным и клеточным пространствами было ограничено проницаемостью, и поэтому использовались коэффициенты проницаемости (PSi), которые представляли пассивную диффузию в каждой ткани. Распределение MMAE на клетки крови или клеточное пространство было охарактеризовано с использованием значений KP. Рассчитанные значения КП были скорректированы с учетом отношения объема клеточного пространства к общему объему ткани путем деления значений КП на соотношение в каждой ткани.Сообщалось, что связывание MMAE с белками плазмы составляет 17,1–28,5% у мышей и обезьян [4], и, следовательно, мы приняли 20%, что означает, что 80% MMAE не связано в плазме (fu, p). Предполагалось, что только свободный MMAE диффундирует через клеточную мембрану, и, таким образом, доля несвязанного лекарственного средства в клетках крови или клеточном пространстве ткани (fu, t) была рассчитана с использованием уравнения (2) [15]. Характеристика и прогноз концентрации MMAE в месте действия (то есть в опухоли) важны для установления надежной взаимосвязи между воздействием и эффективностью.Поэтому модель расположения опухоли на клеточном уровне была включена в модель MMAE PBPK [16]. В модели опухоли, как показано на рисунке 1c, MMAE позволяли перемещаться между плазмой и внеклеточным пространством опухоли посредством сосудистого обмена (экстравазация) и поверхностного обмена (диффузия), который определялся коэффициентом проницаемости (P) и диффузия (D) соответственно. Оба пути также зависели от плотности сосудов и размера опухоли (уравнение (20)). MMAE во внеклеточном пространстве опухоли может проникать в опухолевую клетку и связываться с тубулином.Связанный с тубулином MMAE может диссоциировать от мишени и вытекать из внутриклеточного пространства опухоли во внеклеточное пространство.2.6.2. Уравнения модели
Уравнения (3) и (4) описывают концентрации MMAE в клетках крови и плазме соответственно. Уравнения, описывающие концентрацию ММАЭ в печени (уравнения (5) – (9)), легких (уравнения (10) – (14)), типичной ткани (уравнения (15) – (19)) и опухоли (уравнения ( 20) – (23)) приведены ниже. В этих уравнениях Qplasmai и QBClung представляют собой поток плазмы и поток клеток крови к ткани i.Vplasma и VBC – это объемы центральной плазмы и компартментов клеток крови. Vplasmai, VBCi, Vendoi, VISi и Vcellulari – это объемы сосудистых, кровяных, эндосомных, интерстициальных и клеточных компартментов для ткани i. Cplasma и CBC – это концентрация MMAE в системных компартментах плазмы и клеток крови. Cplasmai, CBCi, Cendoi, CISi и Ccellulari представляют собой концентрацию MMAE в сосудистых, кровяных, эндосомных, интерстициальных и клеточных компартментах ткани i. PSBC – это коэффициент проницаемости для субкомпартмента клеток крови.Глоссарий параметров, связанных с опухолью, представлен в таблице 1.Компартмент крови
2.6.3. Подбор модели и оценка параметров
Физиологические параметры для мышей были получены из нашей ранее опубликованной модели PBPK [22]. Значения и источники связанных с опухолью параметров перечислены в таблице 1. Радиус кровяного капилляра опухоли (Rcap), среднее расстояние между двумя капиллярами (Rkrough), объем пустот в опухоли для MMAE (ε), P, D и скорость оттока. ММАЭ из клеток (коут) были получены из литературы [17,18,19].Сообщалось, что равновесная скорость диссоциации (KD) MMAE для свободного тубулина составляла 291 нМ [20], а константа скорости диссоциации (koff) MMAE до тубулина была принята равной 0,545 (1 / час) [16], и, таким образом, рассчитанная константа скорости ассоциации (kon) ММАЭ для тубулина составила 0,00187 (1 / нМ / ч). Расчетные параметры включали (1) коэффициент проницаемости (PSi) во всех тканях, кроме кишечника, тимуса и других отделов, для которых не было данных наблюдений, (2) внутренний печеночный клиренс (CLint) и (3) скорость неспецифического поглощения MMAE в раковые клетки (родственники).Модель была адаптирована к данным с использованием метода оценки максимального правдоподобия в ADAPT версии 5 (Ресурс биомедицинского моделирования, Университет Южной Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния, США) с использованием модели дисперсии, показанной в уравнении (23). Выше Vi представляет собой дисперсию i-й точки данных, Yi – прогноз i-й модели, а σ1 и σ2 – параметры модели дисперсии. Окончательная производительность модели была оценена на основе наблюдаемых графиков по сравнению с прогнозируемыми, информационного критерия Акаике, визуальной проверки наблюдаемых графиков по сравнению с прогнозируемыми и CV% оценок параметров.Для количественной оценки характеристик модели процент ошибки прогноза (% PE) для плазмы и всех тканей был рассчитан с использованием уравнения (24).% PE = AUC0-t, пред-AUC0-t, obsAUC0-t, obs × 100%
(24)
Выше, AUC0-t, pred – это AUC0-t профилей PK, предсказанных моделью, и AUC0-t, obs – AUC0-t наблюдаемых профилей PK.
3. Результаты
На фиг. 2 показаны измеренные профили PK MMAE в плазме, тканях и опухолях. Концентрация MMAE в плазме быстро упала, всего на 0.3% введенной дозы остается через 5 мин. Через 12 часов концентрация в плазме была ниже предела количественного определения (BLQ). Продолжительные концентрации MMAE в тканях и опухоли наблюдались по сравнению с плазмой. Концентрация MMAE в опухоли оставалась стабильной, а концентрация снизилась всего на 50% с 1 до 168 часов. Концентрации MMAE во всех тканях, кроме печени, можно было измерить через 24 часа. Концентрация MMAE в печени, которая была основной тканью выведения препарата, поддалась количественному определению только до 6 часов.Некомпартментный анализ (NCA) показал, что AUC MMAE в плазме от 0 до 12 ч составляла 54,3 нг · ч / мл, а AUC от 0 до бесконечности составляла 54,5 нг · ч / мл, что указывает на то, что большая часть системного воздействия MMAE было ограничено 12 часами. MMAE продемонстрировал быструю системную CL (60 мл / ч), короткий период полувыведения (2,5 часа) и большой объем распределения (Vss = 42 мл), что предполагает обширное тканевое распределение MMAE. В таблице 2 показаны значения AUC0-t для плазмы, тканей и опухоли, а также значения Kp до и после корректировки на фракционный объем клеточного пространства.После корректировок значения Kp были в 1,2 раза (мышцы и жир) – в 1,8 раза (легкие). Kp для красных кровяных телец составлял 5,5, что указывает на то, что распределение MMAE в красных кровяных тельцах относительно высокое. MMAE быстро и широко распределялся в тканях и сохранялся локально, что привело к значениям Kp> 1 во всех тканях, в диапазоне от 1,25 до 35,3, за исключением головного мозга. Кажущийся Kp в печени был скорректирован с учетом CLint, поскольку это элиминирующая ткань. После учета CLint KP в печени с поправками на фракционный клеточный объем и без них составил 16.1 и 25,3 соответственно. На основании профилей концентрации в тканях и времени и значений Kp кинетику распределения MMAE в тканях можно разделить на три группы. Во-первых, в тканях с высокой перфузией, включая легкие, почки, сердце, печень и селезенку, наблюдалось быстрое и обширное распределение MMAE с соотношением AUC ткани к плазме> 20. Во-вторых, в тканях с плохой перфузией, включая жир, поджелудочную железу, кожу, в костях и мышцах Kp колеблется от 1,3 (мышцы) до 2,4 (жир). В-третьих, распределение MMAE в головном мозге было ограниченным, при этом воздействие на мозг составляло только половину системного воздействия.Следует отметить, что MMAE стабильно оставался в опухоли в течение 168 часов, тогда как в более поздние моменты времени в плазме обнаруживалось лишь небольшое количество лекарства. Общая экспозиция MMAE в опухолях MDA-MB-468 была в восемь раз выше, чем экспозиция в плазме. На рисунке 3 показаны наблюдаемые и согласованные с моделью PBPK PK профили MMAE в плазме, тканях и опухолях. Модель PBPK хорошо захватила ПК в плазме, тканях и опухоли одновременно. В таблице 3 приведены параметры модели PBPK, оцененные с использованием данных. CLint был оценен с хорошей точностью (% CV = 8.92), а оптимизированное значение составило 137 мл / ч. Расчетное значение CLint из подгонки модели PBPK было сопоставимо со значениями, экстраполированными из значений CLint (CLint, vitro) in vitro, которые были рассчитаны с использованием исследований метаболизма MMAE в гепатоцитах печени человека (3 мкл / мин / 10 6 клеток) или человеческих микросомы печени (24 мкл / мин / мг) [21]. Значения CLint in vivo, рассчитанные с использованием гепатоцитов и микросом, составили 101 и 187 мл / ч соответственно. Расчетное значение CLint модели PBPK также было аналогично значению CLint, полученному из нашего анализа NCA данных PK in vivo, где расчетное значение составляло 150 мл / ч.Пожалуйста, обратитесь к разделу «Обсуждение» для получения подробной информации о CLint. Скорость неспецифического поглощения MMAE опухолевыми клетками оценивалась с хорошей точностью (% CV = 19,3), и оптимизированное значение составляло 0,182 л / ч. Значения коэффициента проницаемости и площади поверхности (PS) были оценены с хорошей точностью (% CV Таблица 4 суммирует количественное сравнение наблюдаемых и предсказанных моделью PBPK профилей PK MMAE в форме% PE. Модель лучше всего характеризует легкие, сердце, почки, и данные по коже с% PE4.Обсуждение
PK всего тела MMAE имеет важное значение для понимания токсичности MMAE-конъюгированных ADC. Однако ни в одном исследовании не было проведено всесторонней количественной оценки распределения MMAE in vivo. Здесь мы представили первое в истории исследование биораспределения MMAE в организме мышей с опухолями, в котором концентрации MMAE были количественно определены в плазме 11 тканей (например, сердца, печени, легких, селезенки, почки, поджелудочной железы, жира, мозга , кожа, мышцы и кости) и опухоль. Мы создали модель PBPK и включили PK-модель опухоли на клеточном уровне, чтобы одновременно охарактеризовать расположение MMAE в системном кровотоке и в месте действия.Эта модель MMAE PBPK может служить отправной точкой для разработки модели платформы PBPK для конъюгированных с MMAE ADC, которая может использоваться для облегчения доклинического перевода в клинический и лучшего понимания безопасности и эффективности ADC в клинике.
PK-профиль MMAE в плазме быстро падал, в то время как концентрации в тканях сохранялись в течение длительного периода времени. Это могло быть из-за связывания MMAE с его внутриклеточной мишенью, тубулином. Обычный моментный анализ данных PK показал быструю CL и большой объем распределения MMAE, что соответствует наблюдаемым профилям концентрации в тканях.И PK-профили, и NCA показали, что MMAE широко распределяется в тканях и, возможно, удерживается в тканевых клетках. Поскольку профили концентрации в плазме и тканях не были параллельны, одного воздействия плазмы может быть недостаточно, чтобы служить фактором токсичности, индуцированной MMAE. Период полувыведения MMAE в нашем исследовании был немного короче, чем зарегистрированное значение (2,5 часа против 5,7 часа), и, как и ожидалось, он был значительно короче, чем период полураспада, указанный после введения конъюгированного с MMAE ADC (2.5–3 дня), что осложняется кинетикой, ограниченной скоростью образования [4,16,23]. Наши результаты относительно распределения MMAE в клетках крови не соответствовали литературным данным. Отношение MMAE в крови к плазме, как сообщается, составляет 2 [4] и 1,53–8,65 [8] в различных исследованиях после бесплатного введения MMAE. Принимая во внимание, что более низкое соотношение крови к плазме наблюдалось при введении MMAE-конъюгированных ADC [4]. Наши результаты показали, что соотношение MMAE в крови и плазме составляло около 6 в первые моменты времени (данные о концентрации не были получены для желудочно-кишечного тракта и вилочковой железы, и, таким образом, было сделано предположение при расчете значений KP для этих тканей на основе результата. количественного авторадиографического исследования трастузумаб-vc-MMAE у крыс [7].В ходе исследования наблюдалась стойкая радиоактивность ММАЭ в тканях с быстро делящимися клетками, таких как эпителий желудочно-кишечного тракта, костный мозг, селезенка и тимус. Соответственно предполагалось, что кажущиеся КП в желудочно-кишечном тракте и тимусе такие же, как в селезенке, и они были скорректированы с учетом фракционного клеточного объема каждой ткани. Значения КП были> 1 во всех тканях, кроме мозга, что указывает на то, что воздействие MMAE было выше в большинстве тканей по сравнению с плазмой. Обширное распространение MMAE наблюдалось в тканях с высокой перфузией (т.например, легкое> селезенка> печень> сердце), где воздействие было> 15 раз выше, чем воздействие плазмы. Умеренное распределение MMAE наблюдалось в жировой ткани, поджелудочной железе, коже, костях и мышцах, где воздействие было примерно в 2 раза выше, чем воздействие плазмы. Эти результаты хорошо согласуются с результатами исследования радиоактивности [8] и количественного исследования авторадиографии всего тела [7], в которых сообщается, что радиоактивность была относительно высокой в тканях с высокой перфузией на 1-й день после введения дозы. КП мозга был относительно низким, а воздействие на мозг составляло примерно половину системного воздействия.Сообщается, что MMAE является субстратом транспортеров P-гликопротеина [5], которые могут участвовать в оттоке MMAE из мозга. Таким образом, различия в распределении MMAE в тканях могут быть объяснены различиями в скорости перфузии крови, скорости проникновения через тканевые клеточные мембраны или вовлечении переносчиков. Модель PBPK смогла хорошо охарактеризовать PK MMAE в плазме, тканях и опухоль. Прогнозируемая модель и наблюдаемые концентрации для легких, сердца, кожи и почек были очень похожи (% PE 22], можно дополнительно комбинировать эту модель MMAE PBPK с моделью антитела PBPK для создания платформенной модели PBPK конъюгированных с MMAE ADC [13 ].Сообщается, что выведение (метаболизм и экскреция) MMAE происходит в основном через метаболизм, опосредованный CYP3A4, экскрецию с желчью / калом или экскрецию с мочой [4]. Около 80% MMAE выводится с калом и только 6% выводится с мочой. Поэтому мы предположили, что MMAE выводится только через метаболизм и экскрецию с желчью / калом из печени. CLint, оцененный с помощью модели PBPK, был сопоставим со значениями, рассчитанными с использованием данных in vitro и in vivo. Для получения CLint на основе данных in vitro, CLint, vitro оценивали с использованием гепатоцитов человека (3 мкл / мин / 10 6 клеток) и микросом печени человека (24 мкл / мин / мг) [21].Экстраполяция in vitro – in vivo применялась для расчета метаболической CL in vivo (CLin vivo) MMAE с использованием уравнения (25).CLin vivo = CLint, in vitro · масштабные коэффициенты · масса печени мышей
(25)
Используемые масштабные коэффициенты составляли 135 ± 10 (10 6 клеток / г) для гепатоцитов [24] и 41,9 ± 24,5 (мг / г) [25] для исследований микросом. Предполагалось, что метаболическая ХЛ и неметаболическая (в основном желчная) ХЛ составляют 40% и 60% от общей ХЛ. Это предположение основано на исследовании баланса массы человека [4] и исследовании на крысах с канюлированием желчных протоков, в котором сообщается, что ≈60% MMAE выводится в неизмененном виде с желчью [9].Таким образом, CLint, экстраполированный из исследования in vitro, составлял 109–126 мл / мин (гепатоциты) и 121–462 мл / мин (микросомы). CLint, аппроксимировавшая наши данные in vivo, составила 146 мл / мин с использованием обычного моментного анализа и с учетом хорошо перемешанной модели, низкой экстракции лекарственного средства и независимой от концентрации CL. Связывание с белками плазмы играет жизненно важную роль в распределении небольших тканей в тканях. молекулы лекарств. Сообщается, что связывание с белками плазмы MMAE зависит от вида, с более высокими уровнями у крыс и людей (67.9–82,2%) по сравнению с мышами и обезьянами (17,1–28,5%) [4]. На основании представленных данных о мышах, fu, p было принято равным 0,2, и его использовали в качестве параметра, не зависящего от концентрации в модели PBPK. Следует отметить, что зависимость несвязанной фракции от видов следует учитывать при дальнейшем расширении текущей модели MMAE PBPK для различных видов. Основываясь на гипотезе свободных гормонов [26], предполагалось, что только свободный MMAE может переноситься через клеточную мембрану, и, таким образом, фракция свободного лекарства в каждой ткани учитывалась в модели PBPK.Предполагая линейные и неизменные во времени условия, была рассчитана доля несвязанного лекарственного средства в каждой ткани и клетке крови (уравнение (2)) и включена в модель PBPK. PS описывает перенос лекарственного средства между плазмой / клеткой крови с ограниченной проницаемостью. и межуточное / клеточное пространство. По сравнению с региональной скоростью кровотока относительно низкие значения PS указывают на необходимость учета свойства проницаемости в модели PBPK. Кроме того, значения PS могут быть увеличены с помощью аллометрического уравнения с показателем степени 0.67 [27,28], который регулярно используется для увеличения площади поверхности тела. Фиксированное значение показателя степени 0,67 для PS обычно используется в предположении, что проницаемость клеточной мембраны ткани и структура органа одинаковы у разных видов [28]. С другой стороны, прямое увеличение CL, оцененное на основе модели PBPK, должно быть оценено критически. В нашей модели PBPK, которая была создана на основе данных на мышах, печень была единственным органом, выводящим MMAE. Принимая во внимание, что выведение почками, как сообщается, выше у людей (т.е., 23–41%) [4]. Следовательно, внепеченочный клиренс и видовые различия следует учитывать при расширении модели MMAE PBPK на более высокие виды. В клинике частота гематологической и неврологической токсичности является самой высокой для MMAE среди всех других обычно используемых полезных нагрузок. У пациентов, получавших MMAE-конъюгированные ADC, постоянно сообщалось о трех основных токсических эффектах, включая периферическую невропатию, анемию и нейтропению [6]. Удивительно, но периферическая невропатия, которая наблюдалась у 50% пациентов, получавших брентуксимаб ведотин, не была предсказана на основании доклинических токсикологических исследований на крысах и обезьянах [29].Одно из возможных объяснений заключалось в том, что измерялась только PK плазмы, но не PK ткани MMAE [30,31], что подчеркивает, что использование только системной PK не может быть в состоянии установить переводимую взаимосвязь «воздействие – токсичность» для ADC. Наше исследование показало, что воздействие MMAE в тканях и эритроцитах относительно выше и сохраняется в течение более длительного периода времени по сравнению с воздействием плазмы, что может привести к высокому распространению периферической невропатии (то есть онемения и покалывания в конечностях) через остановка сети микротрубочек, нарушение аксонального транспорта и дегенерация периферических нервных окончаний [12].Другое объяснение токсичности может заключаться в том, что высокая концентрация MMAE в клетках крови вызывает апоптоз эритроцитов, что приводит к снижению кровотока и нехватке питательных веществ, транспортируемых к периферическому нерву, что постепенно вызывает дегенерацию. Кроме того, от MMAE ожидается токсичность для костного мозга, такая как анемия и нейтропения, поскольку это ингибитор тубулина, нацеленный на быстро пролиферирующие клетки [4]. Рассчитанный нами КП для кости был> 1, а концентрация MMAE в кости сохранялась с течением времени, что подтверждает высокую частоту токсичности костного мозга в клинике.В исследовании фазы II брентуксимаб ведотина, вероятность объективного ответа (ЧОО) снижалась с увеличением минимальной концентрации ММАЭ [32,33]. Кроме того, есть отчет, предполагающий, что побочный эффект ADC усиливается с уменьшением минимальных концентраций MMAE [32,33]. Хотя не было дано четкого объяснения этим наблюдениям, они предполагают, что концентрации свободного MMAE в плазме могут не отражать токсичность / эффективность ADC MMAE, и необходимо учитывать тканевое распределение MMAE.Хотя наши данные подчеркивают важность измерения / прогнозирования PK ткани свободных полезных нагрузок, важно отметить, что в клинике измерения в основном выполняются в плазме, и плазменная PK ADC по-прежнему может служить жизнеспособным фактором для установления экспозиции. –– отношения отклика для АЦП, сопряженных с MMAE. Кроме того, учитывая ограниченную по скорости образования природу воздействия свободного MMAE после введения ADC и различную фракцию несвязанного MMAE у разных видов, наблюдаемая нами PK свободного MMAE у мышей может не иметь прямого отношения к установлению токсикодинамических отношений для MMAE-конъюгированных ADC у животных. клиника.Представленная здесь PBPK модель MMAE может быть использована для оценки межлекарственных взаимодействий MMAE, содержащих ADC. Исследования in vivo и in vitro показывают, что MMAE является субстратом CYP3A и P-гликопротеина [34]. Таким образом, полиморфизм CYP3A и P-гликопротеина может влиять на PK MMAE и, следовательно, на эффективность и токсичность ADC, конъюгированных с MMAE. Таким образом, модель MMAE PBPK может служить инструментом для изучения лекарственного взаимодействия ADC. Есть некоторые ограничения нашего исследования. Во-первых, для построения модели PBPK использовался только один уровень дозы MMAE.Однако текущая доза ММАЭ 0,1 мг / кг может быть достаточно высокой, чтобы насытить цель, и, таким образом, можно предположить линейную ПК. Это предположение было основано на результатах токсикокинетических исследований на крысах, которые показали, что уровень отсутствия наблюдаемых побочных эффектов при однократной дозе (NOAEL) составлял 0,01 мг / кг и> 0,116 мг / кг вызывала смертность [4]. По мере того, как становится доступным больше данных при более низких уровнях доз, модель PBPK может быть дополнительно уточнена для уточнения взаимодействия MMAE-тубулин. Во-вторых, PK-профиль свободного MMAE в опухоли, представленный в этом исследовании и предсказанный моделью PBPK, может не отражать воздействие MMAE, наблюдаемое после введения MMAE-конъюгированного ADC.ADC использует компонент моноклональных антител для доставки цитотоксических лекарств в опухоль, экспрессирующую антиген. После целевого связывания ADC подвергается интернализации и высвобождению полезной нагрузки с последующим накоплением полезной нагрузки в месте действия. С другой стороны, PK MMAE в опухоли после внутривенного введения MMAE не зависит от взаимодействия ADC с мишенью и в основном определяется способностью полезной нагрузки проникать и оставаться в опухолевой ткани и раковых клетках. Таким образом, параметры, специфичные для полезной нагрузки (например,g., проницаемость, коэффициент диффузии и т. д.) и параметры опухоли (например, плотность сосудов, размер опухоли и т. д.) вместе вносят вклад в профили PK MMAE, сообщаемые нами. Следовательно, частота и степень воздействия свободного MMAE в опухоли, представленные в этом исследовании, могут отличаться от той, которая наблюдалась после введения MMAE-конъюгированного ADC. Кроме того, поскольку системное воздействие ADC относительно дольше по сравнению со свободным MMAE, в общем воздействии MMAE, наблюдаемом после введения ADC, преобладает конъюгированный MMAE, а вклад свободного MMAE минимален (т.e.,Lift Jack, Регулируемая фиксирующая подставка для подъема Стол для ремонта мотоциклов Утюг Черный Красный Устойчивый Прочный Прочный для мотоцикла Подъемник для велосипеда, Регулируемый по высоте 33,5-46 см Автомобильные рамы и фитинги
Подъемный домкрат, регулируемая фиксированная подъемная подставка Стол для ремонта мотоциклов Утюг Черный Красный Устойчивый Прочный Прочный для мотоцикла Подъемник для велосипеда, регулируемый по высоте 33,5-46 см
Наш широкий выбор элегантен для бесплатной доставки и бесплатного возврата, ДОСТАВКА и ВЕСНЫЕ РАСХОДЫ :, Q98BABY Комбинезон с длинными рукавами для новорожденных Комбинезон с принтом английского бульдога: Одежда.Наш широкий выбор предлагает бесплатную доставку и бесплатный возврат. Номер модели позиции: YJKZXH-20180930DDK1SLXM02574DKBZMOA. США 5/6 лет: талия 11 / длина 26 / бедра 17. Вы также можете сообщить нам по электронной почте, что вам нужен стиль. Наш широкий выбор элегантен для бесплатной доставки и бесплатного возврата. ❤Пожалуйста, не обращайте внимания на размер бирки в комплекте с одеждой. Купите беззубую мужскую свободную рубашку в стиле вестерн на пуговицах и другие повседневные рубашки на пуговицах на. Подъемный домкрат, регулируемая фиксирующая подъемная стойка, стол для ремонта мотоциклов, утюг, черный, красный, стабильный, прочный, прочный, для подъемника для мотоцикла, велосипеда, регулируемый по высоте 33.5-46 см , дата первого упоминания: 20 января. Идеальный подарок для вашего маленького принца или принцессы, США Small = Китай Средний размер: Длина: 27. Американский малый = китайский средний размер: длина: 25, Рекомендованный возраст: хлопковые комбинезоны с длинным рукавом, идеально подходящие для детей в возрасте 0-18 месяцев; перед покупкой ознакомьтесь с информацией о размерах. US X-Small = Китай Средний: Длина: 28, наш широкий выбор предлагает бесплатную доставку и бесплатный возврат. Розовая лента с лентой для выживших после рака груди. Автомобильная наклейка с магнитом. Сверхмощная водонепроницаемость: автомобили, GGBAILEY D3911A-S1A-GY-LP Custom Fit Car Коврики на 2009 год, 5 вставок (Orange Heart Girl): корпус – ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при соответствующих покупках, Lift Jack , Регулируемая фиксированная подъемная подставка для ремонта мотоциклов, утюг, черный, красный, стабильный, прочный, для подъемника для мотоцикла, велосипеда, регулируемая по высоте 33.5-46 см . Гибкая замена АБС – наши комплекты для замены АБС заменяют каждую резиновую часть в тормозных системах АБС, нижнее отверстие 3 дюйма подходит для большинства масляных ламп большого размера, порог для паники с защелкой Pemko, полностью застегивающийся на молнию кожух подушки, 72-дюймовый соединительный кабель для невидимого ленточного света 24 В. Это позволяет легко брать с собой патроны при смене токарного станка. 13 дюймов в длину x 4 дюйма в ширину x 2, эксклюзивно представлены на Amazon. Купите Skysun Water Shoes Mens Womens Barefoot Skin Aqua Water Shoes Quick Drying Swim, вы также будете защищены от вредного воздействия ультрафиолетовых лучей. Подъемный домкрат, регулируемая фиксированная подъемная подставка Стол для ремонта мотоциклов Утюг Черный Красный Устойчивый Прочный Прочный для мотоцикла Подъемник для велосипеда, регулируемый по высоте 33,5-46 см .
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться у системного администратора.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Введение
ВведениеВозникновение множественных вирусных инфекций повсеместно в естественных популяциях, что может иметь значительные эпидемиологические и биологические эффекты [1,2]. Это чаще всего наблюдается у лиц с ослабленным иммунитетом, например у лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) [3]. Среди острых вирусов инфекция респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и вирус гриппа у людей была наиболее часто встречающейся смешанной инфекцией [3]. Вирус чумы мелких жвачных (PPRV) и вирус orf (ORFV) [4], PPRV и вирус синего языка (BTV) [5], PPRV и другие респираторные вирусы [6], PPRV и вирус оспы коз [7], PPRV и Border вирус болезни [8], PPRV, BTV, чума крупного рогатого скота и вирус лихорадки Рифт-Валли [9] – это некоторые из смешанных инфекций, которые наблюдались у животных.Доказательства множественной вирусной инфекции в большинстве вышеупомянутых исследований были определены некультуральными методами (серология / геном), однако выделение и очистка вируса, особенно более чем одного вируса, не были хорошо задокументированы.
PPRV представляет собой вирус с отрицательной цепочкой РНК, который принадлежит к роду Morbillivirus семейства Paramyxoviridae [10,11], тогда как вирус ящура (ящур) представляет собой вирус с положительной цепью РНК, который принадлежит к роду Apthovirus в семействе Picornaviridae [12].PPRV сгруппирован в четыре генетические линии (линия I-IV), но предполагается, что перекрестная защита происходит между штаммами PPRV всех различных линий. Однако ящур имеет семь различных серотипов (O, A, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3) и несколько подтипов, и перекрестная защита не происходит даже внутри подтипов определенного серотипа [12, 13]. И PPRV, и ящур вызывают острую инфекционную инфекцию, которая приводит к значительным экономическим потерям для животноводческой отрасли [14,15], и, следовательно, оба классифицируются как болезнь, внесенная в список Международного эпизоотического бюро (МЭБ).Клинические признаки обоих заболеваний имитируют и характеризуются лихорадкой, эрозивными поражениями на слизистых оболочках полости рта и выделениями из слюны и носа, которые трудно дифференцировать клинически. За исключением молодых животных, которые могут умереть от миокардита, животные, инфицированные ящуром, обычно выздоравливают после острой инфекции без какой-либо значительной смертности. Ящур вызывает легкое заболевание у мелких жвачных, которое может не проявляться клинически [12,16]. Несмотря на то, что они составляют самую большую часть домашнего скота, восприимчивого к вирусу ящура, овцы и козы, как правило, игнорируются с точки зрения их эпидемиологической роли [16].Тем не менее, как овцы, так и козы могут стать переносчиками ящура и, следовательно, действовать как резервуар для дальнейшего заражения и распространения болезни. Таким образом, торговля живыми овцами и козами представляет серьезный риск проникновения ящура в благополучные страны [16]. С другой стороны, инфекция PPRV приводит к высокой заболеваемости и смертности мелких жвачных животных [17–19] с субклинической инфекцией крупного рогатого скота и буйволов [14].
В зависимости от времени заражения смешанная инфекция классифицируется как коинфекция, когда оба вируса заражают одновременно, или как суперинфекция, когда один вирус вторгается в хозяина раньше, чем второй вирус [20].Вирусное вмешательство – это явление, при котором один вирус подавляет репликацию других вирусов. Если оба вируса принадлежат к одному семейству, интерференция называется гомологичной вирусной интерференцией [21], тогда как внутри одного и того же вида, но разного серотипа она называется гетеротипической интерференцией [22]. Среди вирусов разных семейств это называют гетерологичной интерференцией [20]. Коинфекция может привести либо к сосуществованию (вирусная аккомодация) обоих вирусов, либо к элиминации (исключение вируса) [23] одного и выживанию другого (персистентность).Эпидемиология ЧМЖ и ящура во многом пересекается, и в настоящее время оба являются эндемичными в большинстве частей Африки и Азии [14,24–27], что позволяет предположить, что может иметь место смешанная инфекция ящуром и вирусом папилломы человека. Обнаружение и очистка множества вирусов от смешанных инфекций представляет собой серьезное препятствие в таких эпидемиологических исследованиях, и поэтому их необходимо установить.
Результаты Выделение и идентификация возбудителейУ пораженных коз преимущественно наблюдались поражения на языке и деснах, хромота из-за набухания межпальцевого промежутка (несколько животных), слезотечение (несколько животных), слюноотделение, слизисто-гнойные выделения из носа, одышка, диарея (несколько животных). ) и смерть со смертностью 51.63%. Клинические признаки указывали на смешанную инфекцию PPRV и FMDV.
Как показано на рис. 1A, по сравнению с отрицательным контролем (Minimum Essential Medium, MEM), один клинический образец оказался положительным как для PPRV (337 нуклеотидов), так и на сегменты генов, специфичных для ящура (327 нуклеотидов), которые подтвердили PPRV / Смешанная инфекция ящура у пораженного козопаса. У одного животного был обнаружен отрицательный геном вируса ЧМЖ, но не геном вируса ящура, что позволяет предположить, что оно могло быть вакцинировано против вируса ЧМЖ.
10.1371 / journal.pone.0156110.g001 Рис.(a) Выявление геномов, специфичных для вируса вируса папилломы человека и вируса вируса папилломы, в клинических образцах: вирус (ы), выделенный из клинического образца вместе с отрицательным контролем (только MEM), были протестированы на сегменты генов, специфичных для вируса вируса папилломы и вируса вируса гепатита, с помощью ПЦР. (b) Выделение вируса: конфлюэнтные монослои совместно культивированных клеток BHK-21 / Vero инфицировали вирусом, выделенным из одного образца (выделения слюны), в течение 6 часов (ч) с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды.Через 5-7 дней после заражения клетки замораживали-оттаивали и полученный супернатант клеточной культуры (ВР1) использовали для повторного заражения свежих клеток. Такие слепые ходы продолжались до появления CPE. (c) Обнаружение PPRV и генома, специфичного для вируса ящура, в супернатантах культур клеток, инфицированных ложным вирусом, и инфицированных вирусом, в точке BP6.
Клеточные линии BHK-21 и Vero – это признанные клеточные линии, обычно используемые для выделения ящурных вирусов и вирусов вируса папилломы человека соответственно. Для выделения вируса, в первую очередь, образцы размножали отдельно в клетках BHK-21 и Vero, но вирус-специфический цитопатический эффект (CPE) не наблюдался даже после восьми слепых пассажей (BP).Позже один из клинических образцов, который был положительным как в отношении сегментов генов, специфичных для вируса ящура, так и вируса вируса папилломы человека, был серийно размножен в совместно культивированных клетках Vero / BHK-21. В BP6 CPE, характеризующийся округлением клеток, раздуванием и дегенерацией, был очевиден только в инфицированных вирусом, но не в ложно инфицированных клетках (рис. 1B), что предполагало репликацию / адаптацию вируса (ов) в совместно выращиваемом Vero / BHK-21 клетки. Подобно клиническим образцам, супернатант культуры клеток, инфицированный вирусом, но не ложно инфицированный (ВР6), также оказался положительным как для PPRV, так и для сегментов генов, специфичных для вируса ящура (рис. 1C).Поскольку после каждой инфекции клетки интенсивно промывались фосфатно-солевым буфером (PBS), перенос вируса до BP6 маловероятен, поэтому обнаружение обоих вирусных геномов на этой стадии (BP6) представляло собой свидетельство адаптации PPRV и FMDV в система культивирования клеток.
Очистка PPRVВместо того, чтобы на нижнем пассаже (BP6) (фиг. 2A), супернатант инфицированной клеточной культуры на более высоком пассаже (BP15) (фиг.2B) образовывал бляшки в клетках Vero. Мы выбрали 11 бляшек (рис. 2С) и протестировали их на PPRV и сегмент гена, специфичного для вируса ящура, с помощью ПЦР, где все бляшки (за исключением бляшки 5, где не наблюдалась амплификация) принадлежали PPRV (рис. 2D, верхняя панель).Никакой ящурно-специфической амплификации не наблюдалось ни в одной бляшке (рис. 2D, нижняя панель). Бляшка номер 5, которая была отрицательной для геномов PPRV и FMDV, также не давала CPE, вероятно, она была лишена каких-либо вирусных частиц из-за неправильного выбора. Чтобы приготовить запас очищенного PPRV, одну из бляшек дополнительно амплифицировали в клетках Vero и хранили в морозильной камере с температурой -80 ° C до использования.
10.1371 / journal.pone.0156110.g002 Рис.(а) Анализ зубного налета на нижнем пассаже (ВР6).(b) Анализ зубного налета при высшем пассаже (ВР15). (c) Очистка бляшек: отбирали одиннадцать различных бляшек и ресуспендировали в 500 мкл MEM. (d) Амплификация сегментов генов, специфичных для PPRV (верхняя панель) и FMDV (нижняя панель), из индивидуальных бляшек с помощью ПЦР. (e) qRT-PCR для обнаружения геномов PPRV и FMDV в очищенных от бляшек PPRV (проверка чистоты).
Очищенный PPRV нейтрализовали известной сывороткой против PPRV с титром нейтрализации 128, что свидетельствует о гомологии вируса с индийским вакцинным штаммом.При тестировании с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) было обнаружено, что очищенный исходный PPRV не содержит какого-либо специфического генома ящурного вируса (рис. 2E), что свидетельствует об успешной очистке PPRV. Кроме того, ген матричного (M) белка PPRV амплифицировали с помощью ПЦР и непосредственно секвенировали. Последовательности высокого качества были депонированы в GenBank под номером доступа KP745466. При поиске BLAST последовательности показали самую высокую гомологию (99,66%) с PPRV / India / TN / Gingee / 2014 (GenBank Accession, KR261605.1) и филогенетически сгруппированы в линию PPRV типа IV.Очищенный PPRV был депонирован в Национальном центре коллекций ветеринарных культур (NC-VTCC), Хисар, Индия, под инвентарным номером VTCC AVA 154.
Очистка вируса ящураМы использовали несколько стратегий (таблица 1) для удаления вируса вируса папилломы вируса из вирусной смеси и, следовательно, для получения очищенного вируса вируса ящура. Хотя геном вируса ящура последовательно выявлялся от ВР1 до ВР15, никаких специфичных для вируса ящура бляшек не наблюдалось ни в клетках BHK-21, ни в клетках Vero при использовании всех известных методов анализа бляшек ящура [28–30].
10.1371 / journal.pone.0156110.t001 Таблица 1| S. N. | Стратегия | Замечание |
|---|---|---|
| 1. | Обработка органическими растворителями для уничтожения вируса в оболочке (PPRV) | Неудачный (поскольку концентрация органических растворителей, необходимая для полной инактивации вирусных частиц, была токсичной для клеток-мишеней |
| 2. | Удаление гемагглютинирующего вируса (PPRV) | Не удалось полностью адсорбировать PPRV |
| 3. | Анализ зубного налета для очистки ящура и / или PPRV | Успешно для PPRV, но не удалось восстановить специфические бляшки как в клетках Vero, так и в клетках BHK21 |
| 4. | Анализ предельного разведения для очистки PPRV и FMDV | Неудачно |
| 5. | Нейтрализация сывороткой против PPRV для устранения PPRV | Ограниченный успех.При более высоком пассаже, когда ящур начинает формировать ЦПЭ, могут появиться дефектные мешающие частицы, которые препятствуют образованию бляшек, а также способствуют исчезновению стандартного генома вируса ящура. |
| 6. | Серийный слепой пассаж вирусной смеси для уничтожения одного из коинфекционных вирусов | Не совсем успешно, частично зависит от типа используемой ячейки |
| 7. | Трансфекция вирусной РНК (смесь вирусов) в клетки-мишени | Наиболее эффективные методы удаления вируса с отрицательной цепочкой РНК из вирусной смеси и, следовательно, очистки вируса с положительной цепью РНК. |
PPRV – вирус в оболочке, чувствительный к органическим растворителям. Поэтому, чтобы очистить вирус ящура от вирусной смеси, мы сначала попытались инактивировать PPRV этанолом и изопропанолом (80% этанол, 5% изопропанол) [31], а затем инфицировали клетки BHK-21 и / или Vero для амплификации. При нецитотоксической концентрации (<1,25%) обработка этанолом и изопропанолом была неэффективной для полной инактивации репликации PPRV, поскольку геном PPRV и FMDV обнаруживался в супернатанте инфицированной клеточной культуры (данные не показаны).Другие методы очистки ящура, такие как гемагглютинация с помощью куриных эритроцитов (эритроцитов) (для устранения PPRV) и анализ предельного разведения, также оказались не вполне успешными (таблица 1).
Ящур представляет собой вирус с положительной цепочкой РНК, поэтому считается, что он продуцирует инфекционный ящур при трансфекции его РНК в клетки-мишени [32]. После трансфекции РНК (вирусной смесью) в клетки BHK-21 мы наблюдали CPE только в клетках, которые получали РНК из вирусной смеси, но не в клетках, которые получали ложную РНК (рис. 3A).Через 48 часов после трансфекции (hpt), когда супернатант трансфицированной клеточной культуры оценивался на предмет выявления ящурных и PPRV-специфических генных сегментов, можно было обнаружить только ящур, но не PPRV (рис. 3B), что свидетельствует о высвобождении только вирионов ящура из вируса ящура. трансфицированные клетки и, следовательно, устранение PPRV.
10.1371 / journal.pone.0156110.g003 Рис.РНК экстрагировали из 400 мкл супернатанта клеточной культуры, собранных либо из ложно инфицированных, либо из инфицированных вирусом ВР15 клеток, с последующей трансфекцией в клетки BHK-21.(а) Цитопатический эффект на клетки BHK-21, трансфицированные ложной РНК и вирусной РНК, при 48 hpt. (b) Амплификация сегментов гена, специфичных для вируса ящура (верхняя панель), но не специфичных для вируса вируса папилломы (нижняя панель), с помощью ПЦР в супернатантах трансфицированных культур клеток. GMEM и смесь вирусов (ВР15) использовали соответственно в качестве отрицательного и положительного контролей для выделения РНК и ПЦР. (c) Клетки BHK-21 инфицировали в трех повторностях при MOI 1 в течение 1 ч с последующей промывкой и добавлением свежего GMEM. Частицы вируса инфекционного потомства, высвобожденные в супернатантах инфицированных культур клеток в указанные моменты времени, количественно оценивали путем определения TCID 50 в клетках BHK-21.(d) Образование бляшек очищенным вирусом ящура.
. При использовании праймеров для ПЦР, специфичных для серотипа вируса ящура, амплификация наблюдалась только с праймерами, специфичными для типа О (данные не показаны), поэтому вирус принадлежал к серотипу «О» вируса ящура. Затем продукт ПЦР очищали на геле и непосредственно секвенировали с использованием праймера для обратной ПЦР. Последовательности были депонированы в GenBank под номером доступа KP745467, который показал наивысшую гомологию (98,76%) с изолятом ящура типа O IND298 (634) / 2013 (GenBank Accession KJ825804.1). Небольшую 5’-нетранслируемую область (UTR), которая была амплифицирована с использованием независимых от серотипа праймеров FMDV, также секвенировали с использованием праймера для обратной ПЦР и регистрировали с помощью регистрационного номера GenBank KP757899. Частичные последовательности 5’UTR также показали наибольшее сходство (100%) с изолятом ящура типа O IND250 (541) / 2013 (GenBank Accession KJ825809.1).
Для определения кривой роста клетки BHK-21 инфицировали ящуром при множественности инфицирования (MOI), равной 1, и инфекционный ящур, высвобождающийся в супернатанте клеточной культуры в различные моменты времени, титровали, определяя инфекционную дозу для культуры ткани 50 (TCID 50 ).Как показано на фиг. 3C, не было значительного увеличения вирусных титров в супернатантах, собранных через 2 часа после инфицирования (hpi) и 3 hpi. Обнаруживаемое количество вирусных частиц в эти более ранние моменты времени (2 hpi и 3 hpi) представляло фоновый уровень (вход), который оставался прикрепленным к сосуду / клеткам даже после промывки после заражения. Однако наблюдался резкий рост вирусного титра в супернатантах при 5 hpi или позже, что указывало на то, что новые вирусные частицы-потомки начали высвобождаться из инфицированных клеток где-то около 5 hpi по завершении одного полного цикла репликации вируса (рис. 3C).Жизненный цикл ящура составляет ~ 5 часов [33–36], поэтому эти данные согласуются с предыдущими отчетами.
Очищенный вирус ящура продуцировал бляшки в клетках BHK-21 в течение 48 часов (рис. 3D) и был нейтрализован известной сывороткой против вируса ящура с титром 32. Эти результаты отражают отсутствие значительного антигенного и генетического разнообразия исследуемого вируса ящура. Очищенный ящур был депонирован в NC-VTCC под регистрационным номером VTCC AVA 153.
Долговременная совместимость вируса ящура / вируса вируса папилломы в совместно культивируемых клеткахСпецифические геномы вируса ящура и вируса вируса папилломы могут быть обнаружены даже при более высоком пассаже (ВР15) (рис. -временное сосуществование ящура и PPRV.
По сравнению с 2 hpi и 12 hpi, резкое повышение титра вируса на 24 hpi в супернатанте инфицированной клеточной культуры (сокультивированных клеток) свидетельствует об образовании и высвобождении новых частиц потомства вируса на этой стадии (рис. 4A). Титр вируса увеличивался до 96 hpi, он стал стабильным между 120 hpi и 144 hpi, а затем начал постепенно снижаться при 168 hpi.
10.1371 / journal.pone.0156110.g004 Рис.Конфлюэнтные монослои совместно культивированных клеток BHK-21 / Vero или отдельных типов клеток (клетки Vero или BHK-21) инфицировали в трех повторностях (12-луночный планшет для культивирования клеток) 100 мкл супернатанта клеточной культуры (BP15) в течение 2 часов. с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды.Высвобождение вируса в супернатанте инфицированной клеточной культуры (совместно культивированные клетки BHK / Vero) в указанные моменты времени количественно оценивали путем определения TCID 50 (a). Надосадки инфицированных клеточных культур от клеток Vero (b) и BHK-21 (c) в указанные моменты времени тестировали на геномы, специфичные для PPRV и FMDV, с помощью qRT-PCR. Уровни вирусной РНК, выраженные в виде значений порогового цикла (CT), анализировали для определения относительного кратного изменения числа копий РНК за 2 hpi. Планки погрешностей указывают на SD. Статистический анализ проводился с помощью критерия Стьюдента (*** = P <0.001).
Чтобы оценить, способен ли вирус (ы), адаптированный к совместно культивированным клеткам Vero / BHK-21, реплицироваться в одном типе клеток, клетки BHK-21 и Vero были по отдельности инфицированы смесью вирусов (ВР15), и вирус высвободился. в супернатанте инфицированной клеточной культуры в различные моменты времени количественно определяли с помощью qRT-PCR. По сравнению с 2 hpi, очень значимое увеличение относительного числа копий РНК как PPRV, так и FMDV наблюдалось в более поздние моменты времени у обоих Vero (через 96 часов, в 414 и 223 раза увеличилось соответственно PPRV и FMDV) (рис. 4B) и BHK-21 (303-кратное увеличение ящура через 24 часа и 8-кратное увеличение PPRV через 72 часа) (рис. 4C), что позволяет предположить, что оба вируса были способны реплицироваться в одном типе клеток.
Вирусная интерференцияОчищенная вирусная инфекция, но не смесь вирусов (от BP6 до BP15), образовывала бляшки в клетках BHK-21 (фиг. 3D и 5A), что позволяет предположить, что PPRV препятствовал образованию бляшек ящура. Однако очищенный PPRV при совместном инфицировании с очищенным ящуром не препятствовал образованию бляшек ящура (рис. 5A), что указывает на другие возможности, такие как образование дефектных интерферирующих вирусных частиц (DI).
10.1371 / journal.pone.0156110.g005 Рис.(a) Анализ бляшек ящура в клетках BHK21 (b) Конфлюэнтные монослои клеток BHK-21 были инфицированы в трех повторностях PPRV с MOI 1. При 12 hpi клетки суперинфицировали FMDV с MOI 1 в течение 1 часа. с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды. Частицы вируса инфекционного потомства, высвобожденные в супернатант в указанные моменты времени, количественно оценивали путем определения TCID 50 в клетках BHK-21. (b) Клетки BHK-21 трансфицировали в трех повторностях PPRV, NDV, RV или ложной (клеточной) РНК.Через 6 часов клетки промывали PBS и инфицировали вирусом ящура при MOI, равном 1, с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды. Частицы вируса инфекционного потомства, высвобожденные в супернатантах инфицированных культур клеток, количественно оценивали путем определения TCID 50 . Показанные результаты являются средними по крайней мере из трех независимых экспериментов. Планки погрешностей указывают на SD. Статистический анализ проводился с помощью t-критерия Стьюдента (*** = P <0,001, * = P <0,05).
Для того, чтобы продемонстрировать вирусную интерференцию между PPRV и ящуром, клетки BHK-21 были либо ложно инфицированы, либо инфицированы PPRV, а затем суперинфицированы ящуром, и вирус, высвобожденный в супернатанте, был определен количественно.Как показано на фиг. 5B, по сравнению с суперинфекцией PPRV / FMDV, только ящур реплицировался намного быстрее и с более высоким титром, что свидетельствует о том, что PPRV мешает репликации вируса ящура. Здесь стоит упомянуть, что в клетках BHK-21, по сравнению с PPRV, для завершения одного цикла которого требуется ~ 72 часа (данные не показаны), жизненный цикл ящура очень короткий (~ 5 часов), поэтому инфекционный вирус, выделяемый в супернатант коинфицированной клеточной культуры считался только вирусом ящура.
Для дальнейшего объяснения механизма вирусной интерференции клетки BHK-21 трансфицировали PPRV (одноцепочечной отрицательной смысловой РНК), NDV (одноцепочечной отрицательной смысловой РНК из того же семейства) или ротавирусной (RV) (двухцепочечной РНК) РНК, а затем инфицированы ящуром.Как показано на фиг. 5C, предшествующая трансфекция РНК PPRV, но не РНК NDV и RV, значительно ингибировала репликацию вируса ящура в клетках BHK-21, что позволяет предположить, что индуцированное PPRV вмешательство было специфически направлено против вируса ящура.
Явление вирусной интерференции было исследовано и наоборот, то есть если ящур мешал репликации PPRV. Клетки Vero, которые обладают высокой проницаемостью для PPRV и в которых ящур очень плохо реплицируется, были коинфицированы вирусом PPRV / FMDV, и был произведен количественный анализ вируса, высвобожденного в супернатанте.Как показано на фиг. 6A, по сравнению с коинфицированными клетками титр вируса был значительно выше в клетках, инфицированных только PPRV, что позволяет предположить, что ящур ингибировал репликацию PPRV. Аналогичным образом, при исследовании с помощью qRT-PCR супернатант от инфицированных только PPRV клеток показал значительно более высокое увеличение числа копий РНК по сравнению с коинфекцией PPRV / FMDV (~ 260 раз по сравнению с ~ 67 раз при 96 hpi и ~ 3281 раз по сравнению с ~ 484 раза при 144 hpi) (рис. 6B).
10.1371 / journal.pone.0156110.g006 Рис.Конфлюэнтных монослоев клеток Vero инфицировали в трех повторах одним вирусом (PPRV или FMDV) или коинфицировали PPRV / FMDV, каждый при MOI 1 в течение 2 ч с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды. Вирус, высвобожденный в супернатантах в указанные моменты времени, количественно определяли посредством (а) определения TCID 50 . (b) Относительное кратное изменение количества копий РНК (более 2 hpi).
Интересно, что очищенный ящур не продуцировал CPE в клетках Vero, и, следовательно, не было измеряемого вируса при титровании путем определения TCID 50 (клетки Vero) (рис. 6A).Однако, когда супернатанты исследовали на геном вируса ящура с помощью qRT-PCR, по сравнению с 2 hpi, где, как предполагалось, не производились частицы потомства вируса, значительное увеличение числа копий вируса ящура наблюдалось при 96 hpi (~ 4 раза) и 144 hpi (~ 71 раз) (рис. 6B), что свидетельствует о том, что вирус ящура реплицировался и продуцировал новые вирусные частицы-потомки, хотя они не являются цитолитическими (рис. 6A).
Персистентность, исключение и приспособление вирусаПосле объяснения феномена вирусной интерференции мы были заинтересованы в изучении судьбы коинфицированных вирусов при длительном пассаже in vitro.Поэтому мы провели эксперимент по коинфекции с несколькими комбинациями вирусов (рис. 7A), каждый из которых, как полагают, вызывает острую инфекцию у естественного хозяина. При тестировании на вирусный геном на уровне пассажа 5 в большинстве комбинаций выжил (сохранился) только один коинфицированный вирус, тогда как другой был элиминирован (исключение), за единственным исключением вируса болезни Ньюкасла (NDV) и вируса оспы буйвола (BPXV), где оба вируса сохранялись (аккомодация) (рис. 7А).
10.1371 / журнал.pone.0156110.g007 Рис.(a) Клетки Vero были инфицированы указанными комбинациями вирусов при MOI, равном 1. Надосадочную жидкость инфицированной клеточной культуры собирали через 7-8 дней после инфицирования или раньше, если наблюдалось> 50% CPE и 200 мкл его использовали для следующий отрывок. Было сделано пять таких последовательных переходов. Надосадочную жидкость инфицированной клеточной культуры из 5 -го пассажа подвергали амплификации соответствующего вирусного генома с помощью ПЦР.(б) Кривая роста PPRV. Конфлюэнтные монослои клеток Vero инфицировали в трех повторностях PPRV при MOI 1 в течение 2 часов с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды. Частицы вируса инфекционного потомства, высвобожденные в супернатант в указанные моменты времени, количественно оценивали путем определения TCID 50 в клетках Vero. (c) Кривая роста NDV. Конфлюэнтные монослои клеток Vero инфицировали в трех повторностях NDV в течение 1 ч при MOI, равном 1, с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды.Частицы вируса инфекционного потомства, высвобожденные в супернатант в указанные моменты времени, количественно оценивали путем определения TCID 50 в клетках Vero. (d) Кривая роста BPXV. Конфлюэнтные монослои клеток Vero инфицировали в трех повторностях BPXV при MOI 1 в течение 1 ч с последующей промывкой PBS и добавлением свежей среды. Частицы вируса инфекционного потомства, высвобожденные в супернатант в указанные моменты времени, количественно оценивали путем определения TCID 50 в клетках Vero.
Чтобы более точно понять персистентность, исключение и приспособление вируса, мы также выполнили кривую роста отдельного вируса, где после заражения вирус, высвобожденный в супернатант в разные моменты времени, был количественно оценен путем определения TCID 50 .Хотя жизненный цикл вируса может зависеть от природы вируса, MOI вируса и используемых типов клеток, при аналогичном MOI новые дочерние вирусные частицы (жизненный цикл) были обнаружены в супернатанте инфицированной клеточной культуры при ~ 5 hpi при ящурном вирусе (рис. 3C). , ~ 24 hpi для PPRV (рис. 7B), ~ 12 hpi для NDV (рис. 7C) и ~ 48 hpi для BPXV (рис. 7D). Поскольку жизненный цикл разных вирусов различается, быстрая репликация одного вируса истощила бы ресурсы клетки-хозяина (смерть клетки), и, следовательно, произошло бы исключение второго коинфекционного вируса.
Исчезновение стандартного генома вируса ящура при последовательном пассажес высоким содержанием вируса. Как указано выше, мы также выполнили обработку сывороткой против вируса вируса вирусного гепатита для очистки вируса вируса ящура от вирусной смеси. Смесь вирусов (ВР15) обрабатывали сывороткой против PPRV, и полученную смесь использовали для заражения клеток BHK-21. Через 4–5 дней после инфицирования, когда наблюдался чистый CPE, супернатант инфицированной клеточной культуры собирали замораживанием-оттаиванием и называли BP15.ST. Как и BP15, BP15.ST также не образовывал бляшек (данные не показаны), но неожиданно при дальнейшем пассировании (P = 3) геном ящура не обнаруживался с помощью RT-PCR (праймеры для ПЦР на основе 5’UTR) (фиг. 8A).Аналогичным образом, когда исходная вирусная смесь (ВР15) была подвергнута дальнейшему пассированию, геном вируса ящура также не обнаруживался на уровне пассажа 4 (ВР19) (рис. 8В), что указывает на то, что это явление было просто связано с более частым пассажем, а не с обработкой сывороткой против PPRV, вероятно, имело место. генерацией частиц ДИ (табл. 2). Также было замечено, что по сравнению с вирусом в BP15, который продуцировал CPE на ~ 96 hpi, вирус на BP19 производил быстрый CPE (в пределах 48 hpi) (фиг. 8C). Интересно, что ящур, который был очищен из вирусной смеси с помощью РНК-трансфекции, даже при дальнейшем пассировании (P = 6) вел себя нормально, поскольку он образовывал бляшки, и геном ящура все еще обнаруживался, как и те, которые наблюдались с вирусом дикого типа (рис. 8C).Данные указывают на возможность образования частиц ДИ при более высоком прохождении, которые препятствуют образованию бляшек ящура. Можно также сделать вывод, что по сравнению с нейтрализацией антител метод трансфекции РНК более эффективен при очистке вируса вируса папилломы вируса от вируса вируса папилломы / вируса ящура (таблица 2).
10.1371 / journal.pone.0156110.g008 Рис.(a) Обнаружение генома вируса ящура у ложно инфицированных, инфицированных BP15, инфицированных BP15.ST (BP15, обработанная сывороткой против вируса PPRV) или BP15.ST.P3 (последовательный трехкратный пассаж BP15.ST) -инфицированный супернатант клеточной культуры. (b) Обнаружение генома вируса ящура в супернатанте культур клеток ложно-инфицированных, инфицированных ВР15 и инфицированных ВР19. (c) Обнаружение генома вируса ящура в супернатанте культуры клеток, инфицированном ложно инфицированным, очищенным вирусом ящура (P0) и подвергнутом шестикратному пассированию.
| Метод очистки | Исходный материал | Цитопатический эффект | Геном вируса ящура | Исчезновение стандартного генома вируса ящура при последующем пассаже высокого уровня * | Образование бляшек в клетках BHK21 |
|---|---|---|---|---|---|
| Трансфекция РНК | CS | (-) | (+) | NA | (-) |
| BP8 | (-) | (+) | NA | (-) | |
| BP15 | (+) | (+) | (-) | (+) | |
| Сыворотка против PPRV | CS | (-) | (+) | NA | (-) |
| BP8 | (-) | (+) | NA | (-) | |
| БП15 | (+) | (+) | (+) | (-) |
CS = клинические образцы, BP8 = слепой проход 8, BP15 = слепой проход 15, (-) = отрицательный, (+) = положительный, NA = неприменимо.
* Образование частиц ДИ.
Возвращение к очистке ящура непосредственно из клинических образцовМы дополнительно исследовали, возможно ли выделение / очистку ящура непосредственно из клинических образцов и вируса в BP8 (нижний пассаж). Как показано в таблице 2, вирусная смесь из исходного клинического образца, а также из BP8, обработанная сывороткой против PPRV или подвергшаяся трансфекции, не вырабатывала CPE в клетках BHK-21, что позволяет предположить, что ящур оставался нецитолитическим при нижнем пассаже и CPE, наблюдаемый на нижнем уровне прохождения, в первую очередь был вызван PPRV.Поскольку геном вируса ящура обнаруживался при каждом пассаже, ожидалось, что репликация вируса будет происходить постоянно.
ОбсуждениеСмешанные вирусные инфекции могут влиять на тяжесть заболевания, трансмиссивность, иммунопатологию и эффективность вакцины [37]. И ЧМЖ, и ящур – это разрушительные с экономической точки зрения болезни со схожей эпидемиологией. Наши результаты являются первым отчетом, который проиллюстрировал смешанную инфекцию PPRV / FMDV у полевых коз. Мы наблюдали около 50% смертности пораженных козопасов. Смертность у козопасов, пораженных ЧМЖ, колеблется от 10 до 90% [38], тогда как инфекция ящура не вызывает никакой смертности, за исключением некоторых молодых животных, которые могут погибнуть от миокардита [39], следовательно, вклад ящура в увеличение или уменьшение тяжести заболевания не удалось установить.За исключением нескольких исключений [40], где отмечалось, предыдущие отчеты также не указывали на какое-либо усиление тяжести заболевания, которое могло бы быть отнесено к смешанным вирусным инфекциям [41–44]. Помимо влияния на тяжесть заболевания, смешанная инфекция может также влиять на скорость репликации вируса, распространение вируса внутри различных типов тканей / клеток, а также распространение и передачу вируса [20]. В отличие от острых инфекций, когда вирус в конечном итоге элиминируется посредством иммунного ответа или уничтожения хозяина, вирус выживает в течение длительного времени у постоянно инфицированных животных и может передаваться другим животным, с которыми контактирует.Перемещение скота и торговля играют ключевую роль в распространении ящура [45,46]. Из-за неявной природы заболевания мелкие жвачные животные обычно игнорируются из-за их эпидемиологической роли в передаче ящура [16,47]. Однако животные, инфицированные ящуром, могут стать носителями и, следовательно, представлять риск попадания ящура в страны, благополучные по болезни [48]. Перекрывающаяся эпидемиология ящура и ЧМЖ [14] может еще больше усложнить ситуацию, поскольку у животных, инфицированных вирусом ЧМЖ [49] и особенно ящуром [50], может развиться стойкая инфекция.
Чувствительность выделения вируса варьируется в зависимости от типа клеток, и отдельная клеточная культура менее полезна для выделения нескольких вирусов [3]. Различные типы клеток, выращенные вместе в одном монослое (совместно культивируемые клетки), были рекомендованы для обнаружения (иммунофлуоресценции) нескольких вирусов [51,52], хотя их точная роль в выделении вирусов недостаточно хорошо документирована. Наша попытка изолировать PPRV и FMDV от смешанной инфекции у коз с использованием одного типа клеток (BHK-21 или Vero) не увенчалась успехом.Совместно культивируемые клетки Vero / BHK-21, в которых адаптировались и PPRV, и FMDV, представляют собой эффективную систему для одновременного выделения PPRV и FMDV от смешанных инфекций. Адаптация природного изолята вируса к системе культивирования клеток влечет за собой модификацию генетического состава вирусной популяции [53]. Независимо от того, произошло ли это просто случайное событие или какие-то специфические взаимодействия, которые привели к адаптации PPRV / FMDV в сокультивированных клетках, но не в единичных клетках, необходимы дальнейшие исследования.
Из-за чрезмерного роста одного из коинфекционных вирусов успешная очистка нескольких вирусов от коинфицированных случаев остается проблемой.Частично это можно преодолеть очисткой бляшек и нейтрализацией антител [54], хотя это не всегда успешно, поскольку вирус обычно остается нецитолитическим на более низких уровнях пассажа. Поскольку смесь вирусов не вырабатывала никаких специфических бляшек как в клетках Vero, так и в клетках BHK-21 на любом уровне пассажа, мы использовали некоторые другие возможные методы очистки вируса ящура, а именно; обработка органическими растворителями для устранения PPRV (оболочечного вируса) [31], гемагглютинация для удаления PPRV, анализ конечного разведения для выделения PPRV и / или FMDV, нейтрализация сывороткой против PPRV для устранения PPRV и, наконец, трансфекция смеси вирусных РНК ( BP15) в клетки BHK-21, где ожидалось, что только положительная цепочечная РНК (FMDV), но не отрицательная цепная РНК (PPRV), будет формировать инфекционные вирионы [32,55].Как показано в таблице 1, только методы нейтрализации антител и трансфекции РНК были успешными в устранении PPRV из вирусной смеси, хотя вирус, очищенный с помощью первого метода, не образовывал бляшек. Среди смеси вируса с отрицательной и положительной цепью РНК трансфекция РНК, которую мы впервые применили в этом исследовании, по-видимому, является наиболее эффективным методом устранения вируса с отрицательной цепью РНК (PPRV) и, следовательно, очистки вируса. вирус с положительной цепочкой РНК (ящур).Это могло бы дать представление о выделении и очистке других типов вирусов от естественных смешанных инфекций.
ВирусыРНК продуцируют частицы DI при серийном пассаже с высоким MOI в культуре клеток [56]. Это спонтанно генерируемые мутанты вируса, которые имеют дефектные / удаленные геномы [57], реплицируются быстрее, чем стандартный вирус [58], и обычно требуют другой полнофункциональной вирусной частицы (вируса-помощника) для коинфекции клетки с ней для эффективной репликации [59]. ]. Частицы DI также были описаны во время частого последовательного прохождения FMDV [60].Более того, даже в отсутствие какой-либо стандартной вирусной РНК, комплементация между двумя геномами с дефектной РНК, как было показано, вызывает цитопатологию [58]. Поэтому мы полагали, что отсутствие стандартного генома ящура (но быстрого CPE) при более высоком пассаже (≥ BP 19) в нашем исследовании было связано с образованием частиц DI. Делеции в большинстве геномов DI пикорнавирусов локализуются в 5’-части вирусной РНК [61,62]. При последовательном пассаже с частицами DI уровни стандартной РНК прогрессивно снижаются и могут не обнаруживаться с помощью ОТ-ПЦР [53,58,63], что мы наблюдали в нашем исследовании при ≥BP19.
Образование бляшек стандартным РНК-вирусом может подавляться частицами DI [64]. В отличие от смеси вирусов с высоким пассированием, очищенного вируса ящура (путем РНК-трансфекции) или при совместной инфекции с очищенным вирусом вируса папилломы человека в клетках BHK21 образовывались бляшки, что позволяет предположить, что не вирус вируса вируса папилломы, а, вероятно, частицы DI препятствовали образованию бляшек вируса вируса ящура в смеси вирусов. Поскольку геном вируса ящура обнаруживался в очищенном вирусе ящура даже при> 6 пассажах, механизмы неизвестны, можно сделать вывод, что метод трансфекции действует как фильтр для удаления объектов (возможно, частиц DI), которые препятствуют образованию бляшек.Поскольку бляшки PPRV можно было увидеть на любом уровне прохождения даже при> BP15, был также сделан вывод, что частицы DI не препятствовали образованию бляшек PPRV. Требуются дальнейшие исследования морфологических, антигенных и генетических характеристик частиц DI, которые выходят за рамки данной рукописи.
Мы дополнительно изучили возможность выделения / очистки ящура непосредственно из клинических образцов. В отличие от вируса BP15, исходный клинический образец, а также вирус в BP8 (нижний пассаж), обработанный сывороткой против PPRV или подвергнутый трансфекции, не продуцировали CPE в клетках BHK-21 / Vero, что позволяет предположить, что ящур остается нецитолитическим на более низком уровне пассажа. (BP = 8) и что CPE, наблюдаемый на более низком уровне прохождения, в основном был вызван PPRV.Поскольку геном вируса ящура неизменно обнаруживался вплоть до BP15, ожидалось, что продуктивная репликация вируса ящура будет происходить постоянно во время каждого пассажа в культуре клеток. Таким образом, был сделан вывод, что как трансфекция, так и обработка сывороткой против вируса вируса папилломы человека, вероятно, не вызовут цитолитического вируса ящура при более низком уровне пассажа. Напротив, в предыдущем отчете авторам удалось спасти цитолитический ящур путем прямой трансфекции вирусной РНК, полученной из клинических образцов, в первичные клетки щитовидной железы крупного рогатого скота (BTY) [32], хотя в некоторых случаях, когда количество вирусной РНК было меньше, это еще больше не учитывалось. пассажи требовались до тех пор, пока CPE не был виден в клетках BTY [32].Первичные клетки BTY считаются очень чувствительными к изоляции ящура [65], и поэтому разница в нашем и предыдущем отчете может быть связана с внутренней способностью клеток BTY поддерживать изоляцию ящура.
Исследуемый ящур показал наивысшую гомологию (98,76%) с изолятом ящура типа O IND250 (541) / 2013, и он был нейтрализован известной сывороткой против ящура (вакцинированная сыворотка, вакцинированная против ящура типа O, A и Азия-1) с титром 32. Аналогичным образом, PPRV продемонстрировал наивысшую гомологию (99,66%) с PPRV / India / TN / Gingee / 2014 (филогенетически сгруппирован в линию PPRV типа IV, преобладающую в Индии) и нейтрализован известной сывороткой против PPRV с титром 128, что свидетельствует о коинфекции. не вызывают какого-либо значительного генетического или антигенного разнообразия.
Вирусное вмешательство, явление, при котором инфицированная вирусом клетка становится устойчивой ко второму суперинфицирующему вирусу, как было показано, существует между вирусами, которые могут быть или не могут быть тесно связаны [1,20,66–69]. Некоторые факторы, такие как частицы DI, малая интерферирующая РНК (siRNA), конкуренция за клеточные факторы и врожденный иммунный ответ, могут участвовать в вирусном вмешательстве [20]. Интерфероны, продуцируемые одной инфицированной клеткой, могут мигрировать в другие близлежащие клетки и вызывать в ней состояние устойчивости к противовирусным препаратам.В большинстве случаев сопутствующих инфекций механизм доминирования одного вируса опосредуется интерфероном (опосредовано хозяином) [70,71], однако также может иметь место прямое вмешательство (опосредованное вирусным компонентом) [22]. Наши эксперименты по коинфекции in vitro с PPRV / FMDV в клетках Vero показали, что ящур препятствует репликации PPRV. В коинфицированных клетках Vero ящур реплицировался (количество копий РНК увеличивалось в разы), но не продуцировал цитолитический вирус ящура. Тем не менее, сообщалось о нецитолитическом фенотипе ящура после большого количества последовательных пассажей в клетках BHK-21 [72].Фенотип нецитолитического вируса в непермиссивных клеточных линиях не редкость [73], однако то, как ящур продуцирует нецитолитический фенотип в клетках Vero, требует дальнейшего изучения.
Вирусная интерференция была исследована и наоборот, то есть если PPRV препятствует репликации ящура. Вместо коинфекции суперинфекция вируса ящура в инфицированных вирусом PPR клетках BHK-21 привела к вирусному вмешательству. PPRV очень плохо реплицируется в клетках BHK-21, где доказательства продукции вирусных частиц потомства не наблюдаются раньше 72 hpi, а CPE не могут наблюдаться до 144–168 hpi.Напротив, ящур очень быстро реплицируется в клетках BHK-21 (жизненный цикл ~ 5 часов) и продуцирует CPE в пределах 8-10 hpi. Чрезвычайно медленная репликация PPRV в клетках BHK-21, вероятно, не накапливала значительную нуклеиновую кислоту (РНК PPRV) внутри инфицированных клеток, и, следовательно, не наблюдалось вирусного вмешательства. Однако суперинфекция (при которой заражение PPRV проводилось за 12 часов до заражения ящуром) давала достаточно времени для накопления продуктов гена PPRV и, следовательно, возникновения вирусного вмешательства. Для дальнейшего объяснения механизмов вирусной интерференции, а не вирусной инфекции, мы провели трансфекцию нуклеиновой кислотой (РНК).Предшествующая трансфекция PPRV, но не NDV и РНК RV в клетки BHK-21 привела к снижению репликации ящура, что свидетельствует о том, что репликации вируса ящура специфически препятствовала РНК PPRV и что вмешательство в основном опосредовано вирусом, а не клеточными факторами. Взятые вместе данные свидетельствуют о том, что вирусное вмешательство in vitro зависит от природы вируса, типов клеток, используемых для коинфекции, и временного интервала первичной и вторичной вирусной инфекции [20,74,75].
Несмотря на вирусную интерференцию, наблюдаемую в отдельных типах клеток, мы наблюдали долгосрочную совместимость PPRV / FMDV в совместно культивируемых клетках.Ящур [36] и PPRV [14] могут эффективно инфицировать эпителиальные клетки и лимфоциты, хотя другие типы клеток также могут инфицироваться [36]. Это означает, что in vivo, где доступно большое количество типов клеток, может иметь место долгосрочное совместное существование ящура и вируса вируса папилломы человека. Вирусное вмешательство связано с персистирующей инфекцией, но не исключительно с ней [20]. Коциркуляция PPRV и FMDV в одном и том же географическом районе увеличивает возможность межвирусных взаимодействий и, следовательно, гетерологичного вирусного вмешательства.В чем-то похожее наблюдение наблюдалось после суперинфекции вируса чикунгунэа (CHIKV) на комаров, инфицированных вирусом денге (DENV), где оба вируса, как было показано, персистировали вместе [76] в присутствии гетерологичного вирусного вмешательства [77]. Эти наблюдения показывают, что эти вирусы имеют сходные клеточные механизмы, которые контролируют вирусные и клеточные факторы, необходимые для эффективной репликации вируса. Такие клеточные механизмы связаны с факторами хозяина, которые регулируют, но не устраняют вирусную инфекцию, например, те, которые участвуют во врожденной противовирусной защите и РНКи [20].Было показано, что предшествующее инфицирование человека риновирусом эпидемиологически влияет на вирус гриппа [1]. Чтобы выяснить значение смешанной инфекции PPRV / FMDV в изменении передачи и эпидемиологии заболевания в естественной популяции, необходимы дальнейшие исследования долгосрочной персистенции этих двух острых патогенных вирусов in vivo. Тем не менее, наше исследование смешанной вирусной инфекции этих двух экономически важных вирусов животных внесет свой вклад в разработку руководящих принципов торговли домашним скотом, который может в дальнейшем передавать инфекции и эпидемии в странах, благополучных по болезням.
Отсутствуют какие-либо существенные данные о судьбе коинфекции in vitro при длительном пассаже. Основываясь на наших экспериментах по вирусному вмешательству, мы предположили, что только один вирус должен сохраняться при длительном пассаже in vitro. При тестировании на вирусный геном на уровне пассажа 5 в большинстве комбинаций сохранялся только один коинфекционный вирус, а другой был исключен, за единственным исключением коинфекции NDV / BPXV, когда оба вируса сохранялись (аккомодация). Очищенный ящур, хотя и реплицировался (увеличение числа копий вирусной РНК после заражения), не продуцировал CPE (нонитолитический) в клетках Vero, поэтому его исключение, вероятно, происходило при коинфекциях NDV / FMDV, PPRV / FMDV и BPXV / FMDV.При коинфекции PPRV / NDV из-за относительно длительного жизненного цикла PPRV его исключение произошло, как и ожидалось. При коинфекции BPXV / PPRV, хотя PPRV реплицировался намного быстрее (жизненный цикл <24 часов) по сравнению с BPXV (жизненный цикл ~ 48 часов), но, напротив, BPXV сохранялся и PPRV был исключен. PPRV, хотя и начал продуцировать инфекционные вирионы через <24 hpi, не давал наблюдаемых CPE до 96 hpi, тогда как BPXV производил CPE почти в то же время (48 hpi), когда в супернатанте инфицированной культуры клеток были обнаружены признаки нового инфекционного потомства вирусных частиц.Из-за более быстрого развития CPE, BPXV не допускал достаточной репликации PPRV (из-за конкуренции ресурсов ячеек), и, следовательно, PPRV был исключен. Роль частиц DI и гетерологичного вирусного вмешательства в исключении одного коинфекционного вируса представляется сложным внутриклеточным механизмом и требует дальнейших исследований. Интересно, что, несмотря на огромную разницу в продолжительности жизненного цикла, и NDV, и BPXV сохранялись (приспосабливались), отражая потребность различных клеточных факторов для завершения вирусных репликативных циклов.Взятые вместе, можно сделать вывод, что помимо природы вируса и типов клеток, сосуществование и исключение вируса in vitro зависит от динамики репликации вируса и образования CPE. Могут ли NDV / BPXV приспосабливаться друг к другу на дальнейших высоких проходах, а также механизм, лежащий в основе приспособления, необходимо исследовать, что выходит за рамки данной рукописи.
В отличие от сокультивированных клеток, последующий пассаж вируса ВР8 (PPRV + FMDV) в клетках одного типа (Vero) приводил к исключению ящура.Кроме того, когда мы проводили долгосрочные (P = 5) эксперименты с коинфекцией (очищенный PPRV / очищенный FMDV) на клетках BHK-21, PPRV, но не FMDV, были исключены (данные не показаны). Следовательно, сначала пассирование в совместно культивируемых клетках, а затем переход к одному типу клеток при появлении CPE может служить альтернативной стратегией очистки вируса. Однако это будет зависеть от природы вируса (ов) и типа (ов) клеток, используемых для коинфекции, если линия клеток одинаково допустима для обоих вирусов, очистка вряд ли произойдет.Более того, при более высоком проходе образование частиц ДИ может прервать процесс очистки.
Морфологически, антигенно и генетически подтвержденные клинические образцы не всегда приводят к выделению вируса в культурах клеток [78,79]. В нашем исследовании было обнаружено, что коинфекция (вирусная интерференция) влияет на персистентность вируса in vitro, поэтому второй нежелательный (неизвестный) вирус, если он присутствует, может привести к исключению целевого вируса при длительном пассаже и, следовательно, приведет к неудаче. изоляции.
Помимо документирования естественной смешанной вирусной инфекции у коз, мы описали in vitro стратегии успешного выделения и очистки множества вирусов. Такие факторы, как природа коинфекционных вирусов, тип клеток, используемых для коинфекции, временной интервал первичной и вторичной вирусной инфекции, а также динамика репликации вируса и образования CPE, определяют вирусное вмешательство и долгосрочную совместимость in vitro и, следовательно, могут влиять на изоляцию вируса в система культивирования клеток. Дальнейшее изучение таких систем может помочь в разработке более эффективных руководящих принципов для международной торговли животными и продуктами животного происхождения.
Материалы и методы ВспышкаСерьезная вспышка с уровнем смертности 51,63% у коз, клинические признаки напоминающие симптомы ЧМЖ и ящура, была зарегистрирована на фермерском пастбище в Шахджадпуре, Матхура, Индия (декабрь 2013 г.). Парные слюны и мазки из носа (n = 6) у инфицированных животных были собраны после должного согласия фермера и доставлены в лабораторию на льду. Животные были приобретены из нескольких источников примерно за 2 месяца до начала вспышки. Местный фермер не предпринимал попыток вакцинации (ЧМЖ и / или ящура), и в прошлом не было четкой истории вакцинации.
Идентификация вирусных агентов в клинических образцахВирус (ы) выделяли из клинических образцов в MEM (Sigma, Steinheim, Германия) и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Вирусную РНК экстрагировали с помощью набора QIAmp Viral RNA Mini (Qiagen, Hilden, Германия). кДНК синтезировали в соответствии с протоколом, описанным производителем (Fermentas, Ганновер, США). Вкратце, 10 мкл РНК смешивали с 200 нг случайного гексамерного праймера и нагревали до 65 ° C в течение 5 минут, после чего его немедленно охлаждали на льду в течение 5 минут и затем смешивали с 10 мкл буфера 5X RT, 1 мМ. dNTP, 40 ЕД ингибитора РНКазы RiboLock и 200 ЕД Revert Aid H минус обратная транскриптаза в общем объеме реакции 50 мкл.Реакционную смесь инкубировали при 25 ° C в течение 10 мин, 42 ° C в течение 1 часа и 70 ° C в течение 10 минут. Полученную кДНК хранили при -20 ° C до использования.
Для амплификации генома PPRV и FMDV в ПЦР каждая реакционная пробирка объемом 20 мкл содержала 10 мкл мастер-микса для 2X PCR (Promega, Мэдисон, США), 20 пмоль прямого и обратного праймеров и 2 мкл кДНК (матрица) . Условия термоциклера были следующими: этап денатурации 5 минут при 95 ° C, за которым следовали 38 циклов амплификации (30 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 51 ° C и 30 секунд при 72 ° C) и заключительный шаг удлинения при 72 ° C в течение 10 мин.Серотипно-независимая амплификация генома ящурного вируса осуществлялась с использованием универсальных праймеров (прямой праймер: 5′-GCCTGGTCTTTCCAGGTCT-3 ‘и обратный праймер: 5′-CAGTCCCCTTCTCAGATC-3′), которые были основаны на консервативных 5’-UTR ящурных вирусов и были описаны. ранее [80]. Для амплификации гена PPRV-специфического нуклеопротеина (N) были использованы следующие праймеры: прямой праймер: 5’-ACAGGCGCA GGTTTCATTCTT -3 ’и обратный праймер: 5’-GCTGAGGATATCCTTGTCGTT -3’, описанный ранее [81]. Продукты ПЦР обрабатывали в 1% агарозном геле.
Клеточная культура, вирусы и сыворотка.Клетки Vero были закуплены в Национальном центре клеточных исследований (NCCS), Пуна, Индия, и выращены в MEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Sigma, Сент-Луис, США) и антибиотиков. (Пенициллин и стрептомицин). Аналогичным образом клетки BHK-21 были также получены от NCCS, Pune и выращены в MEM Глазгова (GMEM, Invitrogen, Bangluru, Индия) с добавлением 5% FBS и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин, Sigma). Сокультивированные (BHK-21 и Vero) клетки выращивали в соотношении 1: 1 GMEM и MEM.Использовали адаптированный к клеткам Vero вирус болезни Ньюкасла (NDV) (номер доступа, VTCC-AVA155) и поксвирус буйвола (BPXV) (номер доступа, VTCC-AVA90), доступные в NC-VTCC, Хисар, Индия. Сыворотку против PPRV (PPRV / Sungri / 96) без антител против ящура собирали у вакцинированных коз в Центральном институте исследований на козах (CIRG), Матхура, Индия. Сыворотка против ящура (тип O, A и Азия-1) вакцинированного буйвола была доступна в нашей лаборатории в CIRG.
Адаптация вируса (ов) в культуре клетокВирус, выделенный из клинических образцов (фильтрат), использовали для заражения сливающихся монослоев совместно культивированных клеток BHK-21 / Vero [первый слепой пассаж (BP1], и клетки ежедневно контролировали под микроскопом. для внешнего вида CPE.Через семь дней после первого заражения клетки дважды оттаивали замораживанием и полученную суспензию использовали для повторного заражения свежей сокультуры клеток BHK-21 / Vero (BP2). Слепые ходы продолжались до появления КПЭ.
Очистка PPRVДля очистки PPRV в первую очередь проводили анализ бляшек в клетках Vero с использованием супернатанта инфицированных вирусом клеток (ВР6) в качестве исходного материала, но бляшек не наблюдалось. Вирус (ВР6) далее пассировали до образования бляшек в клетках Vero при ВР15.Мы взяли 11 бляшек и протестировали их на генные сегменты, специфичные как для вируса ящура, так и для вируса PPR. Одна из бляшек, специфичных для PPRV, была дополнительно амплифицирована, чтобы подготовить исходный материал PPRV для дальнейшего анализа.
Анализ бляшек PPRVКлетки Vero выращивали в шестилуночных планшетах (Corning, NY, USA) до 90–100% конфлюэнтности перед инфицированием 500 мкл серийных 10-кратных разведений вируса в MEM в течение 24 ч при 37 ° C. После удаления среды клетки инкубировали при 37 ° C в агаровом покрытии, содержащем 13,8 г / л среды L-15 (Leibovitz, Sigma, St.Louis, США), 15 мМ HEPES (pH 7,5), 0,75 г / л бикарбоната натрия, 0,125% (мас. / Об.) Бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,05% DEAE-декстран, 0,5% FBS, заменимые аминокислоты, антибиотики и 0,5% (мас. / Об.) Агар. Бляшки появлялись на 7 -й день, после чего добавляли второй слой агара, дополнительно содержащий 0,03% нейтрального красного, и инкубировали в течение 24 часов перед подсчетом бляшек.
Характеристика очищенного от бляшек вируса PPRV. Известную сыворотку против вируса PPRV использовали для нейтрализации вирусной инфекционности. PPRV-специфический полноразмерный ген M также был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием прямого праймера: 5′-CAGCATGGGATGTCAAAGGGTC -3 ‘и обратного праймера: 5′-CATCGTTGATGATGACATCATCGTAGACAC-3’ в идентичных условиях, описанных в других местах рукописи, за исключением температуры отжига, которая сохранялась. при 54 ° С.Очищенный из геля продукт ПЦР секвенировали напрямую с использованием прямого праймера для ПЦР. Последовательности депонированы в GenBank.
Очистка вируса ящура. Наша попытка очистить вирус ящура от вирусной смеси методом бляшек не увенчалась успехом. Поскольку PPRV представляет собой оболочечный вирус и чувствителен к органическим растворителям, мы попытались удалить его из вирусной смеси, обработав этанолом и изопропанолом (80% этанол, 5% изопропанол) [31], используя максимальную нецитотоксическую концентрацию (1,25). %).Цитотоксическую концентрацию смеси этанол / изопропанол определяли методом МТТ ([3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2H-тетразолийбромид], как описано ранее [82]. гемагглютинация (HA) куриными эритроцитами была также выполнена для удаления PPRV из вирусной смеси. Аналогичным образом, вирусную смесь на BP15 сначала обрабатывали (2 часа при 37 ° C) сывороткой против PPRV (5: 1), а затем инфицировали до Клетки BHK-21 в течение 2 ч при 37 ° C с последующей промывкой PBS и добавлением свежего GMEM.Вирус собирали через 4–5 дней после заражения путем замораживания-оттаивания и тестировали на генные сегменты, специфичные для вируса ящура и вируса PPR.
Трансфекция вирусной РНКВирусную РНК экстрагировали из ложно-инфицированных или инфицированных смесью вирусов (ВР15) клеток с использованием мини-набора для вирусной РНК QIAmp (Qiagen, Hilden, Германия), как описано в другом месте рукописи. Клетки BHK-21 выращивали в 12-луночных планшетах для культивирования тканей, и когда монослой становился конфлюэнтным на ~ 80%, его трансфицировали 250 нг РНК с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine® MessengerMAX ™ (Invitrogen, Carlsbad, USA) в соответствии с протоколом, описанным в производитель. Через 6 часов клетки промывали трижды PBS с последующим добавлением свежего GMEM.Клетки наблюдали ежедневно на предмет появления CPE. Через 48 часов супернатант инфицированной клеточной культуры собирали и оценивали на предмет специфичных для вируса вируса папилломы человека и вируса ящура сегментов генов с помощью ПЦР.
Инфекция ящураОчищенный вирус ящура амплифицировали и титровали в клетках BHK-21. Вкратце, ~ 90% конфлюэнтных монослоев клеток BHK-21 были инфицированы вирусом ящура (если не указано иное, при MOI = 1) в течение 1 часа при 37 ° C с последующей трехкратной промывкой PBS и добавлением свежего GMEM (замененного 1% FBS. ). Супернатант собирали, когда> 50% клеток показывали СРЕ.Вирус титровали в клетках BHK-21 путем определения TCID 50 в двукратных серийных разведениях.
Анализ бляшек ящураАнализ бляшек ящура был проведен с использованием некоторых модификаций существующих протоколов [28–30]. Вкратце, клетки BHK-21 выращивали в шестилуночных планшетах до 90–100% конфлюэнтности перед инфицированием 500 мкл серийных 10-кратных разведений вируса в GMEM в течение 45 мин при 37 ° C. После удаления среды клетки инкубировали при 37 ° C в аналогичном агаровом покрытии, описанном в другом месте рукописи.Бляшки появлялись в пределах 48 hpi, после чего наложенный агар удаляли, а чашки окрашивали кристаллическим фиолетовым.
Серотипирование вируса ящураСеротипирование вируса ящура выполняли с помощью ПЦР с использованием серотип-специфичных праймеров, которые были описаны ранее [83]. Продукты ПЦР, амплифицированные с использованием серотип-независимых (5 ‘UTR) и серотип-специфичных (FMDV типа-O) праймеров, были напрямую секвенированы, и полученные последовательности депонировали в GenBank.
Долгосрочные коинфекцииКлетки Vero были коинфицированы комбинацией вирусов, а именно: ящур + PPRV, ящур + NDV, FMDV + BPXV, PPRV + NDV, PPRV + BPXV, NDV + BPXV, каждый при MOI 1 в течение 2 часов с последующей промывкой раз с PBS и добавлением свежего MEM.Вирус собирали, когда> 50% клеток показывали CPE. Если ЦПЭ не было, клетки культивировали в течение 8–10 дней и замораживали-размораживали для сбора вируса. 200 мкл супернатанта клеточной культуры из первого пассажа использовали для заражения свежих клеток для следующего пассажа. Было сделано пять таких переходов. Набор для очистки вирусной РНК / ДНК (Thermoscientific, Вильнюс, Литва) использовали для одновременной экстракции вирусной РНК и ДНК из супернатантов коинфицированных культур клеток. Последовательность праймера для обнаружения NDV (ген слияния) и BPXV (ген C18L) была следующей: NDV; прямой праймер: 5’- GTCTACCAGGCATTCGCTTCTTCTACCAGGATCCCAGCAC -3 ’и обратный праймер: 5’- TGGGTGACTCAATTCTGCTGATGCCTCTAATGGGGCTTT -3’ и BPXV; прямой праймер: 5’-GCGGGTATCACTGTTATGAAACC-3 ’и обратный праймер: 5’-CATAAATACACTTTTATAGTCCTCG-3’.Праймеры, используемые для амплификации PPRV и FMDV, описаны в других местах рукописи. Условия ПЦР были идентичны описанным в других местах рукописи, за исключением температуры отжига, которая поддерживалась на уровне 55 ° C как для NDV, так и для BPXV.
qRT-PCRУровни вирусной РНК в супернатанте инфицированной клеточной культуры определяли количественно с помощью qRT-PCR. Экстракцию вирусной РНК и синтез кДНК проводили, как описано выше. qRT-PCR выполняли с 20 мкл реакционной смеси, содержащей специфические для генов праймеры, матрицу и краситель ДНК Sybr green (Promega, Мэдисон, США), и проводили на системе обнаружения CFX96 RealTime PCR (Bio-Rad, США).Праймеры, используемые для qRT-PCR, были такими же, как описано выше для диагностической PCR. Условия термоциклера были следующими: стадия денатурации 5 минут при 94 ° C, затем 40 циклов амплификации (30 с при 94 ° C, 30 с при 51 ° C и 30 с при 72 ° C). Уровни вирусной РНК, выраженные в виде значений порогового цикла (СТ), анализировали для определения относительного кратного изменения числа копий РНК, как описано ранее [84].
(PDF) Раби Мекка главный рог самасья аевам прабандхан
fnlEcj 2011 izlkj nwr
41
gks tkrs gSa vkSj o`Ur lM + u ds dkj.k ikS / s VwV dj fxj
tkrs gSaA
jrqvk% jrqvk jksx nks izdkj dk gksrk gSA lkekU; jrqvk
vkSj iksyhlksjk jrqvk A
lkekU; jrqvk
iDlhfu; k lksj? kkbZ
} kjk tfur gksrk
gSA ekewyh rkieku (160 и 250 lsa-xzs-) rFkk mPkn vksfu {kr
jqddx jqodx jqod2 jqodx jqodx jqod2 jqod2 vk esa izpqj ek = kk esa iQiQwan ds iQiQksys mRiUu gksrs gSa tkslqugjs Hkwjs jax ds gksrs gSaA iksyhlksjk jrqvk
iDlsyh3000;kksa esa lkekU; jrqvk
tSlk gh gksrk gS] blds chtk.kq lkekU; jrqvk ls yEcs
gksrs gSaA
ifêðr i.kZ rFkk i.kZPNn vaxekjh%; g jksx
jkbtksDVksfu; k lksysukbZ
iztkfrur} dh xeZ vknzzZrk okys] fupys igkM + h {ks = kksa esa rFkk
eSnkuh {ks = kksa esa O; kid: i ls mn ~? kfVr gksrk gSA fupys
i.flds kFizNn es gSaA laØfer
iÙkksa ij oSdfYid xgjs Hkwjs jax dh ifêð; ka cu tkrh gSaA
fodflr HkqV ~ Vk iw.kZr% u “V gks tkrk gS vkSj Hkwlh okyh
ifÙk; k¡ VwV dj vifjiDo fLFkfr esa lw [k tkrh gSaA
jksfey e`nqy% jksi.k ds`000 e’nqy] nqy ds izfr vf / d laosnu’khy gksrh gSA; g
rhu izdkj dk gksrk gS] Hkwjh iV ~ Vhnkj jksfey e`nqy
(dkjd
) iSjksuksLdhyhjksLiksjk lksj kkbZ
) rFkk jktLFkku jksfey e`nqy
(dkjd
iSjksuksLdhyhjksLiksjk ghVªksiksxksuh) А;? г jksx mÙkj
Hkkjr DS fgeky; {кс = kksa rFkk DQN eSnkuh {кс = kksa эша izpfyr
gSA izkjfEHkd y {k.k / Ccksa ds: i esa iÙkksa ij fodflr
gksrs gSa] tks ladh.kZ] gYdh ihyh ifêð; ksa ds: i esa ulksa
} kjk ifjLkhfer gksrs gSaA varr% cêskh gSaA varr% cêskh gsaA varr% 9 ifaxðh ka; cht rS; kj gksrs gSa] iq “ixqPNksa esa fiQykSM + h
fn [kkbZ nsrh gSA foÑr ijkx dk iSnk gksrs gSaA
/ Ccksa dh lrg3h ij [kkbZ nsrh gSA
o`Ur lM + u%; g leL; k ikS / ksa ds fodkl ds nks pj.ksak esa
i`Fkd & i`Fkd dkjdksa ls mRiUu gksrh o` i` gSA 1-0003 Ur lM + u%; g nks izdkj dk gksrk gSA
(d) fifFk; eo`Ur lM + u (dkjd
fifFk; e
, iQsfuM + jesVe
);
xEHkhj leL; k gSA rkieku 30 & 350 lsa-xzs- rFkk 80 & 100%
vkisf {kr vknzZrk bl jksx ds fodkl ds fy, izfrdwy gSA
e`zf jshdjs% kk ¡jshjs kk.
ls lM + u ds lkFk Hkwjh uje gks dj VwV tkrh gS A ijUrq
ikS / k dbZ gÝrksa rd gjk & Hkjk jgrk gS] D; ksafd laoguh
.M + y LoLFk gksrs gSaA
([k) thok.kq o`Ur lM + u% (dkjd
bfoZfu; k
ØkbZlsafFkeh)
]; g jksx mPp rkieku (320 & nbsp) vkSj vf / d vkisf {kr vknzZrk ij lfØ; gksrk gSA
mÙkj Hkkjr ds rjkbZ {ks = k bl leL; k ls xzLr gSaA e`nk Lrj
LVL Åij dh vUr% xzfFk; gSA laØfer ÅÙkd
xy tkrs gSa vkSj lM + u dh nqxZU / vkrh gSA
2. iq “iu mijkUr o`Ur lM + u%; g nks izdkj dk gksrk; gnks izdkj dk gksrk; gSA 9000; qfj
Ur lM + u (dkjdÝ; qtsfj; e
eksfufyiQksehZ
); g mÙkj izns’k] jktLFkku] fcgkj]
vkU / zz izns’k jsa O;k iq “iu ds ckn
Li” V gksrs gSaA tM + ds ‘kh “kZ {ks = k dh vUr% xzfUFk; k¡
jksxxzLr gksrh gSaA rus dh phjus ij o`Ur csa000 t xqyk [9000] nsrk gSA
([k) dkBdks; yk lM + u (dkjd
eSØksiQksfeuk
iQsflvksfyuk
) ] vr% ‘kq “d
{ks = kksa esa eDdk dh [ksrh ij; g jksx xEHkhj izHkko
Mkyrk gSA izHkkfor var% xzfUFk; ¡k lesfdr ughaSOKRX 9000 ¡k lesfdr ughaSDOKJ 9000] gSA o`Ur dh Nky
ij y? kq fiu gSM + tSls dkys Ldfyjksf’k; k fn [kkbZ nsrs gSaA
iNsrh md ~ Bk (dkjd
fliQ3 liksfj 9000; gsm 9000 + 9000 esfj) jksx eq [; r% vkU / z izns’k esa xEHkhj: i ls O; kIr gSA iÙkksa
esa ekewyh xyu gksus yxrk gSA ifÙk; ka eUn gjh gks dj
luphw [k] fgLlk lw [kdj fNyds
dh rjg mrj tkrk gS rFkk [kks [kyk gks tkrk gSA o`Ur
cSaxuh; k xgjs Hkwjs jax dk gksdj xhyh lM + u ds lkFk
izxfyr gks tkrk gSA
.