Универсальный внешний накопитель для всех iOS-устройств, совместим с PC/Mac, Android
Header Banner
8 800 100 5771 | +7 495 540 4266
c 9:00 до 24:00 пн-пт | c 10:00 до 18:00 сб
0 Comments

Содержание

Катушка к ПМА-4200 380В

Выберите категорию:

Все Электротовары » Аппаратура управления »» Клавишные выключатели/ тумблера »» Кнопки управления »» Корпуса постов для кнопок управления »» Ограничители мощности »» Реле и аксессуары »» Переключатели »» Светосигнальная арматура » Силовое оборудование »» Предохранители »» Реле »» Автоматика модульная »»» AVERES EKF »»» АЕ 2046 »»» АЕ 2056/2066 »»» АП 50 »»» ВА 47-29 / 47-63/ 47-100 »»» ВА 57-39 »»» ВА 57Ф35 »»» ВА 99 и др. »»» Выключатель нагрузки »»» Дополнительные устройства на DIN-рейку »»» Модульный переключатель »»» ПРОБКА - АВТОМАТ »»» Разрядники »»» УЗО и Дифференциальные автоматы »»» Шнайдер »» Пускатели/Контакторы/Комплектующие »»» Пускатели »»» Контакторы »»» Комплектующие к пускателям и контакторам »»» Выключатели пуска двигателя серии АПД-32, АПД-80 »»» Дополнительные устройства для КМЭ, КТЭ,КМИ »» Рубильники »»» Модульные рубильники »»» Высоковольтные рубильники »»» Рубильники в корпусе »»» Рубильники без корпуса » Светотехника,Лампы »» Декоративные »» Лента светодиодная »»» Комплектующие к светодиодной ленте »» Лампы светодиодные »»» G13(как люминисцентные) »»» GX53/GX70 »»» JCDR-LED »»» R7s »»» LED-HP-standard »»» Аналоги ЛОН (А-60/А50) »»» Свеча (Е14/Е27) »»» GL120 »»» LED-MO »»» Зеркальные (R39, R50,R63) »»» VINTAGE Filament »»» Шар Р45 »»» Для холодилников »»» Е14 Силикон »» Светильники линейные »» СПП/ССП/СПО »» ЛПО/ЛСП »» Переносные светильники »» Ультротонкие светильники »» Прожектора и переносные светильники »» Панели светодиодные и Комплектующие »» РКУ »» РСП »» ПСХ/НПБ »» Настольные светильники »» Светильники IP65 »» Светильники ЖКХ »» Трековые светильники »» Точечные светильники »» Светильники с датчиком »» Светильники для птицеводства/ФИТО »» Модульные системы освещения »» Дросселя »» Патроны »» Проэкторы »» Светотехника прочая »»» Лампы »»»» Галогенновые »»»» Галогенновые/МГЛ »»»» ДНАТ_ДРИ »»»» ДРЛ_ДРВ »»»» Зеркальные »»»» ЛОН »»»» Люминесцентные »»» ПСХ и НПБ »»» Ночные лампы »»» Фонари и фонарики »»» Садовые и Парковые светильники » Стабилизаторы напряжения » Электроустановочные изделия »» Дверные звонки и кнопки »» Разъемы/Вилки »» Удлинители/Вилки/Аксессуары »» Установочные изделия »»» Блоки »»» Выключатель дистанционный »»» Розетка радиоуправляемая »»» Серия NATA »»» Серия Венеция »»» Серия Вессен »»» Серия Легранд »»» Серия Прага »»» Серия Рим »»» Серия Днепр »»» Серия МИРА »»» Серия Минск » Новогодняя продукция »» Деревья и прочее »» Дюралайт »» Новогодние гирлянды »» Новогодние ЛОН »» Новогодние строблампы »» Новогодние фигурки »» Новогодние светодиодные лампы » Кабельная продукция »» ВВГ »» АВВГ »» ПВС/ ( РПШ тельф) »» ПВ/ ППВ »» СИП и арматура »» КГ - ХЛ/ ПРС »» Кабель для СВЯЗИ »» ШВВП/ ПЩ » Измерительная аппаратура »» Счётчики 1-о фазные »» Счётчики 3-х фазные »» Трансформаторы »» Трансформаторы тока » Кабеленесущие системы »» Труба жесткая ПВХ и Комплекттующие »» Металорукав и Комплетующие »» Кембрик »» Кабельные каналы пластиковые/Аксессуары »» Перфорированные кабельные каналы »» Лотки кабельные металические/Аксессуары »» Гофра и Комплектующие »» МОНТАЖ »»» Изделия для монтажа »»» Гильзы »»» Сжим/СИЗ »»» Дюбель-хомут »»» Наконечники »»» Муфты кабельные »»» Когти, Лазы »»» Изолента /Лента киперная »»» Зажим "Крокодил" »»» Хомуты »»» Распределительные устройства » Коробки монтажные » Корпуса электрощитов »» Корпуса пустые »» Щиты распределительные »» Щиты учёта »» Крепления к столбу »» Аксессуары к корпусам » Комплектующие шкафов »» Пакетные выключатели »» Концевые выключатели »» Кнопки »» Изоляторы Отопление/Водопровод/Кухня » Водонагреватели » Насосное оборудование »» Комплектующие насосов и насосных станций »» Мотопомпы »» Насосные станции »» Насосы »»» Насосы циркуляционные »»» Насосы фонтанные »»» Насосы погружные »»» Насосы поверхностные »»» Насосы низковольтные »»» Насосы канализационные »»» Насосы дренажные » Радиаторы »» Радиаторы AL STI »» Радиаторы ROYAL »» Радиаторы OGINT »» Радиаторы чугунные »» Панельные радиаторы Royal Termo COMPACT »» Комплектующие к алюмин.

радиаторам »» Комплектующие к чугун. радиаторам » Теплый пол »» EKF »» Gulfstream »» ELECTROLUX » Канализационные системы »» Внутренняя канализация »» Наружная канализация »» Трубы канализационные » Измерительные приборы » Вентиляционное оборудование »» Торцевые площадки пластмассовые »» Решетки »» Решетки регулирумые »» Решетки ревизионные »» Патрубок »» Обратный клапан »» Лючки накладные »» Лючки встроенные »» Воздуховод »» Воздуховод канальный плоский »» Воздуховод канальный круглый »» Вентиляторы канальные »» Вентиляторы бытовые »» Анемостаты » Водоотводы » Коллектора » Краны шаровые » Крепеж сантехнический » Мойки для кухни » Гибкая подводка »» Гибкая подводка для воды »» Гибкая подводка для газа » Фильтры/Картриджи/Комплектующие »» Картриджи »» Фильтры »» Комплектующие к фильтрам и картриджам » Полипропилен » Полотенцесушители и комплектующие » Предохранительная арматура » Обжимные фитинги » Резьбовые фитинги » Сантехнические расходные материалы »» Гель, паста »» Клей »» Пена »» Прокладки »» Герметик »» Фум, нить, лен »» Эпоксидный состав (Холодная сварка) Климатические системы » Водяные тепловентиляторы » Вентиляторы » Кондиционеры » Обогреватели »» Тепловентиляторы »» Радиаторы маслянные »» Обогреватели и конвектора настенные »» Тепловые завесы »» Обогреватели инфракрасные »» Камины »» Тепловые пушки »»» Электрические пушки »»» Дизельные пушки »»» Газовые пушки »» ПЭТ » ТЭНЫ »» Аноды и термостаты »» Водяные »» Воздушные »» Прокладки к ТЕН-ам »» Комплектующие к ТЭН-ам » Газовые котлы » Твердотопливные котлы » Электрические котлы » Сушилки для рук » Осушители/Увлажнители » ДЫМОХОДЫ »» Уплотнитель кровельный »» Нержавейка »» Оцинкованные »» Эмалированные Электроинструмент, станки » Бетономешалки » Болгарки » Пылесосы и комплектующие » Гайковерты » Граверы » Станки » Зернодробилки » Компрессоры »» Компрессоры стационарные »» Компрессоры автомобильные » Краскопульты » Дрели » Детекторы металла » Перфораторы » Шуруповерты » Лобзики » Рубанки » Электропилы » Фены » Миксеры » Сварочные аппараты »» Инверторы »» Полуавтоматы »» Маски сварочные »» Электроды, проволока »» Комплектующие к сварочным аппаратам » Фрезы » Лебедки » Пистолеты Клеевые » Плиткорезы » Точила » Шлифмашины » Диски отрезные »» Алмазные диски по Граниту »» Алмазные диски »» Кордщетки »» Круг лепестковый торцевой »» Круг шлифовальный заточной »» Отрезные по дереву »» Отрезные по камню »» Отрезные по металлу »» Пильные диски »» Полировальные »» Тарелка опорная »» Шлифовальные »» Щетки для УШМ и дрели » Сверла - буры - коронки »» Борфрезы »» Буры »» Коронки буровые исверлильные »» Пики - зубило - лопатки »» Сверла »» Шарошка абразивная »» Щетки для инструмента Бензиновая техника » Вибротехника и комплектующие » Генераторы » Культиваторы »» Навесное к культиваторам » Триммеры и газонокосилки » Комплектующие к триммерам и газонокосилкам » Запчасти к культиваторам » Снегоуборщики » Запчасти к снегоуборщикам » Мотобуры и комплектующие » Бензопилы » Комплектующие к бензопилам » Аксессуары для пил » Расходные материалы для мототехники »» 2-х тактное »» 4-х тактное »» Для цепей Автоаксессуары » Компрессоры »» Компрессоры автомобильные »» Компрессоры стационарные » Пневмоинструмент и комплектующие »» Пневмоинструмент »» Пистолет обдувочный »» Регуляторы давления »» Для покраски »» Для подкачки шин »» Фитинги для пневмоинструмента » Мойки и комплектующие » Гайковерты » Прочие подогреватели » Пускозарядные устройства Сад и огород » Аэраторы садовые » Бордюры Заборы » Парники для огорода » Подвязка растений » Рыхлители земли » Садовый инструмент » Секаторы Ножницы Сучкорезы » Таймер для полива » Умывальники Души Щетки » Разбрызгиватели и пистолеты-распылители » Лейки и Ёмкости для воды » Опрыскиватели садовые » Переходники Разветвители » Адаптеры для быстросъемов » Наборы поливочные » Катушки для шлангов » Муфты для шлангов » Шланги поливочные 15 » Шланги поливочные 20 » Шланги поливочные 25 » Измельчители садовые

Производитель:

ВсеABACACUASUBAdidasAgent ProvocateurAguariusAir HeatAirwheelAKGAL STIAllSaints TonyaALTAFOAMAltstreamAntonio BanderasAppleAQVA PIPEARDERIAArmand BasiArtelampASDASOSATLANTICBalliBalluBaonBeatsBekoBELMASHBelmondoBESTOFFBIGHBLOCKBoschBRAITBRAVO TRIOBRIGGS&STRATTONBrilliantBUDERUSBugattiBurberryCamelionCAMOZZICandyCATCITILUXCLIPPERCOLOSSEOColumbiaCOMBATComfortCRISTELLCrocsCrosbyCTMCYCLONEDDEDekoDel'ta luxDemixDENZELDisneyDJIEASYECCOEDISSONEDONEKFEl TempoELECTROLUXEnergyERBAERGUSETALONFEKACUTFEKAMAXFESTFilaForestPlusFORNARAFORWARDFORZAFRAPFree toolsFRESH-KFUBAGGAPGARAGEGARANTERMGironacciGold WheelsGrandpipeGRANGE CASCADAGREENTECHSGrindaGROSSGRUNDFOSGTNGulfstreamH. E.BY MANGOHANDYHappy SocksHERZHITACHIHoffmannHomidoHotpoint-AristonHuaweiHUSQVARNAHUTERHVBRIEKINCITYIndesitINGCOITAITAPJanomeJawboneJazzwayJEMIXKangaROOSKappaKARCHERKolnerKRAFTOOLKRESSLacosteLamplandiaLaura ClmentLD PrideLEOLEZARDLGMAKITAMAKROFIXMandarina DuckMarco TozziMASTERMASTERFIXMastersilMATRIXMAXITAPEMeerPlastMEIBES FlamcoMerrellMezaguzMIDITAPEMieleMONDIGOMULTIPAKMVINavienNavigatorNeohitNikeNONAMENTSODEON LIGHTOgintOKAMIOleo-macOPTIMAOREGONOSRAMOutrageous FortuneOutventurePALISADPalladiumPanasonicPantofola dOroPATRIOTPfaffPhilipsPILAPinaPITPro AquaProConnectPRORABPUTECHQEQGDQUATTRO ELEMENTIQuintRACORADENARAINRalf RingerRAPSTRAPRazerRedmondReimaREMERREMEZAREXANTROYALRubber DuckSADDSADKOSAFELINESalomonSamsungSANIDOUCHESANIVORTSchneiderSEAGULLSERGEY GRIBNYAKOVSHUFTSilicotSKILSLIMSokolovSOLOLIFTSonySPARTASTARWELDSTAYERStelsSTISTIHLSTMSTORMSUNLIGHTSYLVANIATDMTecnicaTHERMEXThink PinkTIMBERKTONWINTop SecretToyotaTYTANUNI-FITTUnielUNIPAKUNIPUMPUNITAPEURAGANUTPVALENAVALTECVero modaVIKINGVitacciWAGOWILOWOLTAYORKZANUSSIZKabelZOTAАграномАдамантАквалинкАквапостАквафорАкцентАлькорАНИ-ПЛАСТАТАКААтлантБамзБАРЬЕРБронницкий ЮвелирВАЛЕНТИНАВекторВидВИКОВИХРЬВладиксВолнаГАЛЛОПГейзерГРАНИТГРОДЭСДемиургДжетДомингоДРАКОНЕРМАКЗебраЗолотовЗУБРЗЭТАИНТЕРСКОЛКАМАКамеяКедрКОБАЛЬТКонтактКордКОСМОСКРАТОНКУБКЭАЗЛИДЕРЛисмаЛоктайтЛУГАМакрофлексМеркурийМоментОдеждаТрейдОКПан ЭлектрикПАРМАПОЛЮСПотокПРАКТИКАПримаПримаЭксклюзивПРОРАБПрофильПРОФМАШПРОФТЕПЛОРаДанРЕКОРДРЕСАНТАРОДНИКРОНДОРОСТОКРосТурПластРубинСАДОВОДСантехникСВЭЛСИБРТЕХСкилСЛАВЕНСоудалСтаврСтоп МастерТАНГИТТВОЕТИССТопазТри О ПрофитФЕРМЕРФеронФотонХИТХРЮШАЭвентЭкоЭконЭНЕРГОМАШЭнергопромЭРАЭстетЮкиноксЮпитерЮСС

Электровоз ВЛ11 | Цепи управления быстродействующими выключателями

Для включения быстродействующего выключателя нажимают кнопку БВ на выключателе БлКн5 (рис. 173). При этом напряжение от шины 18 агрегата У12 (см. рис. 148* и 173) через автоматический выключатель В6, провод 47, зажим ПЗ/7, провод 320, контакт кнопки БВ выключателя БлКн5 подается на провод Э404. Затем через контакт кнопки БВ выключателя БлКн7, провод 405, резистор 436, провод 416, катушку реле РДф1, провод 400, корпус электровоза и параллельно через размыкающий контакт реле РТ34, провод 414, резистор Я37, провод 415, катушку реле РДф2, провод 400, корпус напряжение подается на катушки дифференциальных реле РДф1 (тяговых электродвигателей) и РДф2 вспомогательных машин. Однако реле РДф1 и РДф2 не срабатывают, так как в последовательной цепи резистор-катушка реле (Я36, РДф1 или Я37, РДф2) ток не достигает уставки. Параллельно удерживающей катушке БВ и катушкам дифференциальных реле подключен шунтирующий контур Я41, Д121, необходимый для ограничения э. д. с. самоиндукции, возникающей при разрыве цепи удерживающей катушки БВ.

При кратковременном нажатии на импульсную кнопку Возврат БВ напряжение от провода 503 по цепи: контакты 119-120 и 61-62 контроллера машиниста, замкнутые на нулевых позициях тормозной и главной рукояток соответственно, провод 637, контакт кнопки Возврат БВ, провод Э402, размыкающий контакт реле тока РТЗЗ, провод 403 - подается на катушки контактора К63 и вентиля Возврат БВ. При возбуждении вентиля сжатый воздух поступает в цилиндр БВ и вызывает перемещение включающего рычага. Одновременно включается контактор К63. От АПУ-287 по проводу 319 через замыкающие силовые и вспомогательные контакты контактора К63 получают форсированное питание катушки дифференциальных реле РДф1 и РДф2, и они срабатывают.

От провода 405 через замыкающий контакт реле РДф2, провод 406, контакт РДф1, провод 433, контакт РП29 (контакты реле РКт8 разомкнуты, так как поднят токоприемник), провод 407, контакт тормозного переключателя ПкТ, замкнутый при положении переключателя в тяговом режиме, провод 408, питание подается на удерживающую катушку БВ. Якорь удерживающего электромагнита притягивается к полюсам, но силовые контакты выключателя остаются разомкнутыми до опускания кнопки Воз-враг БВ.

После отключения кнопки Возврат БВ теряют питание катушки контактора К63 и вентиля Возврат БВ. При этом БВ включается и переключаются его вспомогательные контакты. Получают питание катушки реле времени РВ7 и промежуточного РП22 (размножитель вспомогательных контактов БВ). Замыканием контактов реле времени РВ7, имеющего выдержку при возврате 3-5 с, подготавливается цепь катушки счетчика ИП отключений БВ. Катушки дифференциальных реле после отключения контактора К63 продолжают получать питание через добавочные резисторы Я36 и Я37 от провода 405. В режиме рекуперации после поворота вала переключателя ПкТ в тормозное положение удерживающая катушка БВ получает напряжение по цепи: провод 405, замыкающие контакты дифференциальных реле РДф2, РДф1 и реле РП29, размыкающие вспомогательные контакты быстродействующих контакторов КБ45 и КБ46, провод 410 и вспомогательный контакт тормозного переключателя ПкТ.

Быстродействующие контакторы имеют размыкающие силовые контакты; при коротком замыкании в цепи тяговых электродвигателей они отключаются и удерживаются в выключенном положении защелкой. Если силовые контакты одного или обоих быстродействующих контакторов находятся в разомкнутом положении, то их замыкающие вспомогательные контакты замкнуты (нормальное положение силовых контактов быстродействующих контакторов замкнутое) и при нажатии импульсной кнопки Возврат БВ от провода Э402 через замыкающие вспомогательные контакты КБ45 и КБ46 напряжение подается на включающие катушки защелок отключенных быстродействующих контакторов КБ45 и КБ46. При этом защелки освобождают силовые контакты КБ45 и КБ46, последние замыкаются, замыкаются также их размыкающие вспомогательные контакты, включенные в цепи удерживающей катушки БВ, подготавливая цепь включения быстродействующих выключателей. Дальше процесс повторяется аналогично описанному выше.

После размыкания размыкающих вспомогательных контакторов в проводах Э801, Э803 и Э801, Э810 гаснут красные сигнальные лампы 1БВ, 2БВ, ЗБВ и БВ, что свидетельствует о включении БВ на всех секциях. Если на одной из секции БВ не включится, то через вспомогательный контакт в проводах Э801, Э803 сохранит питание сигнальная лампа быстродействующего выключателя (1БВ, или 2БВ, или ЗБВ) соответствующей секции, а через вспомогательный контакт в проводах Э801, Э810 - общая лампа БВ.

Для возможности включения БВ при отключенных кнопках Токоприемник I, Токоприемник II и Токоприемник III схемой предусмотрена шунтировка замыкающего контакта реле РП29 размыкающим контактом реле РКт8. При случайном выключении кнопок находящихся в работе токоприемников, если главная рукоятка контроллера машиниста находилась в рабочем положении, то из-за размыкания контактов реле РП29 удерживающая катушка БВ потеряет питание, он выключится и опускание токоприемников будет происходить при обесточенной силовой цепи электровоза.

Число срабатываний быстродействующего выключателя БВ при повреждениях в цепи тяговых электродвигателей фиксируется счетчиком импульсов ИП, катушка которого возбуждается от провода 598 через замыкающий контакт реле времени РВ7. Катушка реле времени РВ7 получает питание по цепи: провод 320 замыкающий вспомогательный контакт БВ, провод 417. Если БВ срабатывает, то замыкается его размыкающий вспомогательный контакт в цепи катушки счетчика, размыкается замыкающий контакт в цепи катушки РВ7 и она теряет питание. Однако замыкающий контакт реле РВ7 остается на некоторое время замкнутым. Катушка счетчика в это время находится под напряжением, достаточным для его срабатывания. Счетчик не регистрирует оперативных отключений БВ, а также отключений, вызванных повреждениями в цепи вспомогательных машин при нахождении главной рукоятки контроллера в нулевом положении.

После включения БВ от токоведущей шины 003 на каждой секции через главный ввод в силовой контакт БВ напряжение подается по проводу 008, проложенному через дифференциальное реле РДф1, к верхнему кронштейну контактора К10, а через контакты ПкС и высоковольтную пластину П1 - к линейному контактору К1. Через катушку дифференциального реле РДф2 по проводу 201 напряжение подается к верхним кронштейнам электромагнитных контакторов вспомогательных машин и электрических печей по цепи: резистор R18, провод 226, обмотка напряжения счетчика электрической энергии Whl, провод 127, токовая обмотка счетчика Wh3 провод 100, токосъемники Пк2-Пк5, земля. По обмотке напряжения счетчика Whl проходит ток, но его подвижная система не вращается, так как ток через его токовую обмотку не протекает. Одновременно от провода 008 по цепи: катушка реле рекуперации РН11, резистор R16, группа пусковых резисторов R2, провод 018, контакторный элемент / переключателя ПкГ, провод 021, группа пусковых резисторов R1, провод 028, резистор R13, провод 029, катушка реле повышенного напряжения РнЮ, провод 030, катушка реле низкого напряжения РН9, провод 200, корпус -- проходит ток. Якорь реле рекуперации притягивается, и его размыкающие контакты размыкаются, но в цепях никаких изменений не происходит.

| Цепи управления токоприемниками | | Цепи управления вспомогательными машинами |

Страница не найдена

Новости

21. 05.2019

Расширение ассортимента кабельной продукции ГК "ПромЭнергоСнабжение"

С радостью сообщаем вам о том, что ассортимент силовой кабельной продукции компании "ПромЭнергоСнабжение" существенно расширился. По вопросу уточнения стоимости вы можете связаться с нашими менеджерами по телефону: +79520537107 и 8 (4012) 582762 в городе Калининграде. 

Также оперативно отвечаем в Viber v Whatsup по номеру +79520537107.

Заявки просьба направлять по адресу электронной почты [email protected]

 

01.06.2016

Начало поставок продукции LS IS

 

LS IS - мировой лидер в области электроснабжения, автоматизации и зеленых технологий.

01.06.2016

Поставка судовых каблей

Поставка судовых кабелей различного назнеачения.  

24.10.2015

Приборы учёта ННПО имени М.В. Фрунзе в Калининграде

С радостью сообщаем Вам о начале сотрудничества с Нижегородским заводом им. Фрунзе.

 

26.06.2013

"Штиль" - стабилизаторы высокого качества.

 

Рады сообщить Вам о том, что с 1 июля 2013 г. компания "ПромЭнергоСнабжение" официально представляет в Калининграде торговую марку "Штиль".

 

Новинки

Кабель АВВГ 4*70
 


129 р.

 

Контактор R63-20 230V ETI

Описание

Модульные контакторы серии R применяется для дистанционного и автоматического контроля электрических устройств и оборудовавния (цепей освещения, систем отопления, вентиляции, коммутации двигателй небольшой мощности и т. д.). Особенностями контактора является высокая надежность, а так же тихий режим работы. Это позволяет применять эти контакторы в помещениях с высокими требованиями к уровню комфорта.

Характеристики

Гарантия 24 мес.
Время включения/отключения 11-15/6-13 сек.
Защита предохранителя 80 A
Количество модулей 2
Контактная группа 2NO
Механический ресурс 1 млн.
Мощность коммутации AC-3 5 кВт
Напряжение катушки 220 В AC
Рабочий ток AC-1 63 А
Степень защиты IP20
Частота коммутаций 1/600 600

Модуль поглотителя перенапряжения серии MS-N для рабочей катушки, установленный сверху | МИЦУБИСИ

72 дн. AC100 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 (катушка отключения) / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор + подсветка дисплея от 100 до 127 100–125
72 дн. AC200 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 (катушка отключения) / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор + подсветка дисплея от 200 до 240 200–220
72 дн. DC200 SRLD-N4 / K100 (катушка отключения) / SLD-N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRLD-K100 (катушка питания) CR - от 100 до 220
72 дн. AC48 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор от 24 до 50 от 24 до 60
72 дн. AC100 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор от 100 до 127 100–125
72 дн. AC200 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор от 200 до 240 200–220
72 дн. AC400 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор от 346 до 480 -
72 дн. AC100 DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SL-N50 / N65 (катушка отключения) / SLD-N50 / N65 (катушка отключения) Варистор + подсветка дисплея от 100 до 127 100–125
72 дн. AC200 SRL-N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SLD-N21, N35 (катушка отключения) / SL-N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / SRL-K100 (катушка питания) CR от 100 до 240 -
72 дн. AC48 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор + CR от 24 до 50 от 24 до 60
72 дн. AC100 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор + CR от 100 до 127 100–125
72 дн. AC200 SRL (D) -N4 / K100 (катушка отключения) / SR-K6 / K63 / K100 / MS-KR11 / MSO-KR11SR / S-KR11 / SL (D) -N21 / N35 / N50 / N65 (катушка отключения) / DUD-N30 / SD-N50 / N65 / SRD-K100 / SRL (D) -K100 (катушка питания) Варистор + CR от 200 до 240 200–220

K63- Связанный убиквитин необходим для ограничения обратной транскрипции ВИЧ-1 и дестабилизации капсида резусом TRIM5α

РЕФЕРАТ

TRIM5α представляет собой антивирусный фактор рестрикции, который ингибирует ретровирусную инфекцию видоспецифичным образом. TRIM5α связывается и образует сборки вокруг ретровирусного капсида. После связывания, плохо изученные, убиквитин-зависимые события приводят к разборке вирусного ядра до накопления вирусных продуктов обратной транскрипции в клетке-мишени. Также известно, что сборки TRIM5α и других белков семейства TRIM могут быть мишенями аутофагической деградации. Целью этого исследования было определить роль специфических убиквитиновых связей в рестрикции ретровирусов и аутофагической деградации TRIM5α и очертить любую связь между этими двумя процессами.С этой целью мы создали гибридные белки, в которых каталитические домены различных ферментов деубиквитиназы (DUB) с различной специфичностью к полиубиквитинированным связям были слиты с N-концевым доменом RING TRIM5α макака-резуса. Мы оценили роль убиквитинирования в рестрикции и степень, в которой определенные типы убиквитинирования необходимы для ассоциации TRIM5α с аутофагическими белками. Мы определили, что K63-связанное убиквитинирование с помощью TRIM5α необходимо для индукции разборки капсида и ингибирования обратной транскрипции ВИЧ, в то время как способность ингибировать ВИЧ-1 инфекцию не зависела от K63-связанного убиквитинирования. Мы также наблюдали, что K63-связанное убиквитинирование необходимо для ассоциации TRIM5α с аутофагосомными мембранами и аутофагическим адаптерным белком p62.

ВАЖНОСТЬ Хотя механизмы, с помощью которых TRIM5α может вызывать абортивную разборку ретровирусных капсидов, остаются неясными, многочисленные исследования предполагают роль убиквитинирования и путей клеточной деградации. Эти исследования обычно основывались на глобальном нарушении путей клеточной деградации.Здесь, используя специфические для связывания деубиквитинирующие ферменты, связанные с TRIM5α, мы очерчиваем связи убиквитина, которые управляют конкретными этапами рестрикции и деградации с помощью TRIM5α, обеспечивая доказательства неканонической роли K63-связанного убиквитина в процессе рестрикции ретровирусов с помощью TRIM5α. и потенциально обеспечивая понимание механизма действия других белков семейства TRIM.

ВВЕДЕНИЕ

Факторы рестрикции клетки-хозяина - это класс белков, которые ингибируют репликацию вируса, блокируя определенные этапы жизненного цикла вируса. TRIM5α - один из наиболее хорошо охарактеризованных антивирусных факторов ограничения. Члены семейства белков TRIM определяются наличием трехчастного мотива, состоящего из N-концевого домена RING, который функционирует как убиквитинлигаза E3, одного или двух B-боксовых доменов и домена со спиральной спиралью (1, 2). . TRIM5α отличается от других членов этого семейства своим C-концевым доменом PRY / SPRY, который позволяет белкам TRIM5 напрямую связываться с ретровирусным капсидом, белковым ядром, в котором находится вирусный геном (2, 3).При распознавании капсида домены B-бокса и спиральной спирали, которые имеют решающее значение для самосборки среди многих членов семейства TRIM (4-7), способствуют сборке TRIM5 в мультимерную решетку, окружающую вирусное ядро ​​(8-10). . Более того, сборка TRIM5 более высокого порядка также активирует функцию убиквитинлигазы E3 домена RING (11). Посредством образования этой мультимерной сборки TRIM5 способен инициировать свою противовирусную активность, которая включает (i) ингибирование вирусной инфекции, (ii) ингибирование обратной транскрипции вируса и разборку капсида и (iii) синтез связанного с K63 Цепи убиквитина, которые активируют врожденные сигнальные пути и вызывают антивирусное состояние клетки (3, 12–14).

Первоначальные исследования механизма ограничения ретровирусной инфекции белками TRIM5 определили, что TRIM5 вызывает дестабилизацию ретровирусного капсида (3, 15), а ранние модели вызывали механизмы клеточной деградации, такие как протеасома или пути аутофагии, как критические. посредники этой дестабилизации. Несколько групп, включая нашу, определили, что существует ступень ограничения, чувствительная к ингибиторам протеасом; обработка TRIM5α-экспрессирующих клеток ингибиторами протеасом до ретровирусной инфекции позволяет протекать обратной транскрипции вируса, хотя инфекция все еще ограничена, что указывает на существование протеасомозависимой стадии в процессе рестрикции (14, 16-19).Кроме того, резус TRIM5α (RhTRIM5α), который эффективно дестабилизирует капсиды ВИЧ-1 в нормальных условиях, образует стабилизированные комплексы с вирионами ВИЧ-1 в присутствии ингибиторов протеасом (3, 17, 20). Эти комплексы положительно окрашивают убиквитин (17), что указывает на роль убиквитина или убиквитинирования в антиретровирусных функциях TRIM5α.

Убиквитин - это белок из 76 аминокислот, который может быть ковалентно присоединен к остаткам лизина в белках-мишенях, и эта модификация часто является сигналом для направления субстратов на определенные клеточные пути (21, 22).Убиквитин имеет семь внутренних лизинов (остатки 6, 11, 27, 29, 33, 48 и 63), и эти остатки могут сами быть мишенями убиквитинирования, тем самым создавая полиубиквитиновые связи (23, 24). Полиубиквитиновые связи могут быть заякорены на конкретном белковом субстрате или могут не быть заякоренными (25, 26). Важно отметить, что разные полиубиквитиновые связи связаны с разными клеточными судьбами. K48- и K63-связанные полиубиквитиновые цепи являются наиболее распространенными, составляя примерно 80% всех убиквитиновых связей, наблюдаемых в клетках млекопитающих (27).K48-связанные цепи полиубиквитина канонически связаны с направлением субстратов к протеасомам для деградации, тогда как K63-связанные модификации полиубиквитина связаны с эндосомным переносом, внутриклеточной передачей сигналов и репарацией ДНК (21–23, 28–33). Как E3 ubiquitin ligase, TRIM5α, как было показано, подвергается автоубиквитинированию и продуцирует заякоренные K63-связанные цепи убиквитина in vitro (12). Мы и другие наблюдали, что TRIM5α колокализуется с маркерами пути аутофагии (34–36), и эти наблюдения предполагают возможную роль аутофагии в функциях рестрикции TRIM5α.Однако ранее мы установили, что для ограничения ретровирусной инфекции или обратной транскрипции белками TRIM5 не требуется ни ATG5, ни эффекторная молекула аутофагии Beclin1 (34). Остается неясным, требуется ли убиквитинирование для рекрутирования аутофагического аппарата в сборки TRIM5α и какие др. Клеточные белки играют роль в этом рекрутинге.

Таким образом, наша цель состояла в том, чтобы очертить роль убиквитинирования в антиретровирусных функциях TRIM5α и его рекрутирование в аутофагосомы.Мы создали гибридные белки, в которых каталитические домены различных ферментов DUB с различной специфичностью к полиубиквитинированным связям были слиты с N-концевым доменом RING RhTRIM5α (37). Используя эти слитые белки в качестве инструментов, мы обнаружили, что в отсутствие K63-специфической активности убиквитинлигазы TRIM5α образует стабильную ассоциацию с капсидом, позволяя протекать обратной транскрипции; однако заражение все еще заблокировано. Эти данные подтверждают модель, согласно которой образования сборки TRIM5α вокруг капсида достаточно для ингибирования инфекции, тогда как убиквитинирование, связанное с K63, необходимо для разборки капсида и ингибирования обратной транскрипции.Мы также определили, что K63-связанное убиквитинирование с помощью TRIM5α является критическим для его ассоциации с аутофагосомными мембранами, что также требует аутофагического адаптера p62.

РЕЗУЛЬТАТЫ

K63- или K48-специфические слияния DUB влияют на полиубиквитинирование RhTRIM5α в клетках. В стремлении определить убиквитин-зависимые этапы рестрикции с помощью TRIM5α, недавнее исследование нашей группы определило, что требуется функция убиквитинлигазы E3 TRIM5α за его способность дестабилизировать ретровирусные капсиды (38). Белки TRIM5α, в которых деубиквитинирующий фермент UL36 вируса простого герпеса 1 (HSV-1) (здесь обозначаемый как UL36) был слит с N-концевым доменом RING RhTRIM5α (UL36-RhTRIM5α), были способны ограничивать инфекцию ВИЧ-1 (38 ). Однако вирусные ядра в комплексе с UL36-RhTRIM5α накапливались в цитоплазме инфицированных клеток, что свидетельствует о нарушении дестабилизации ядер в отсутствие компетентного убиквитинирования (38). Важно отметить, что клетки, экспрессирующие каталитически неактивную версию DUB (обозначенную звездочкой [*]), названную UL36 * -RhTRIM5α, сохраняли способность как ограничивать инфекцию, так и дестабилизировать вирусные ядра (38).

Для более точной идентификации конкретных детерминант того, как TRIM5α задействует аутофагический аппарат и для определения того, рекрутируются ли стабилизированные TRIM5α-вирусные комплексы в аутофагосомы, мы создали панель слитых белков, в которой каталитические домены различных ферментов деубиквитиназы (DUB) , с различной специфичностью к полиубиквитинированным связям, были слиты с N-концевым доменом RING RhTRIM5α (рис. 1A). В нашем предыдущем исследовании использовался деубиквитинирующий фермент HSV-1 UL36, который, как было показано, расщепляет полиубиквитиновые цепи, связанные как с K48, так и с K63 (39–41).Различные DUB, используемые в данном исследовании, были выбраны из-за их способности расщеплять только один тип связи убиквитина, даже при высоких концентрациях полиубиквитина (37). Поэтому мы слили K63-специфический DUB AMSH-LP и K48-специфический DUB (OTUB1) с N-концом RhTRIM5α; слитые белки обозначаются AMSH-LP-RhTRIM5α и OTUB1-RhTRIM5α соответственно (фиг. 1A). Кроме того, каждый из этих слияний DUB-RhTRIM5α был спарен с каталитически неактивным слитым белком деубиквитиназа-RhTRIM5α для контроля этих N-концевых слияний с RhTRIM5α.

Фиг. 1.

Слитые белки деубиквитиназа-RhTRIM5α ингибируют полиубиквитинирование, связанное с K63 или K48. (A) Схематическая диаграмма слитых белков RhTRIM5α, используемых в этом исследовании. Активные и неактивные (обозначенные звездочкой [*]) слияния DUB получали путем вставки данного фермента в рамку между тегом Flag и стартовым кодоном для RhTRIM5α. (B и C) Клетки HEK293T временно трансфицировали конструкциями слияния DUB с (+) или без HA-Ub (-). Клетки собирали через 48 hpi и иммунопреципитировали шариками, конъюгированными с антителами против Flag.Их оценивали с помощью SDS-PAGE (готовый градиентный гель) и вестерн-блоттинга с указанными антителами. Статус убиквитинирования AMSH / AMSH * -RhTRIM5α (B) и OTUB1 / OTUB1 * -RhTRIM5α (C) оценивали с помощью антител, специфичных для связывания. Стрелками отмечены положения немодифицированных слитых белков. Показанные результаты являются репрезентативными для трех или более независимых экспериментов.

Чтобы проверить способность наших конструкций влиять на убиквитинирование RhTRIM5α, мы временно трансфицировали клетки HEK293T с помощью наших гибридных конструкций с или без убиквитина, меченного гемагглютинином (HA-Ub), и иммунопреципитировали каждый RhTRIM5α антителами против FLAG ранее. описанный (рис.1B и C, вверху слева) (38). Путем блоттинга с антителом против НА мы смогли наблюдать высокомолекулярный убиквитиновый лэддеринг для каталитически неактивного AMSH * -LP-RhTRIM5α, который резко снижался в присутствии активного слитого белка AMSH (AMSH-LP-RhTRIM5α). (Рис. 1B, внизу). Когда мы использовали антитело, специфичное для связывания K63, для наших блотов, лестница убиквитина не была видна, что подтверждает, что слияние AMSH способно удалять K63-связанные цепи убиквитина из RhTRIM5α (рис. 1B, вверху справа).Мы наблюдали аналогичную картину с белками OTUB1-RhTRIM5α. В этом случае, однако, лестница убиквитина для активного OTUB1 была умеренно снижена по сравнению с таковой для каталитически неактивного контроля. В подтверждение этого результата мы наблюдали лестницу высокомолекулярного убиквитина, когда каталитически неактивный OTUB1 * -RhTRIM5α-иммунопреципитированный продукт зондировали антителом убиквитина, специфичным для связи K48, которого не было в каталитически активном аналоге (рис. 1C). , оставили).Эти результаты демонстрируют, что убиквитинирование RhTRIM5α состоит из K63- и K48-связанного убиквитина. Они также демонстрируют, что слитые белки AMSH-LP- и OTUB1-RhTRIM5α эффективно удаляют K63-связанный и K48-связанный убиквитин, соответственно, из RhTRIM5α.

Слитые белки деубиквитиназа-RhTRIM5α ограничивают инфицирование ВИЧ-1. Чтобы понять роль K63- и K48-связанного убиквитина в RhTRIM5α-опосредованном ограничении ВИЧ-1, мы создали клетки A549 и HeLa, стабильно экспрессирующие эти конструкции.В клетках A549, стабильно экспрессирующих RhTRIM5α, слитый с тремя DUB и их ферментативно неактивными контролями, мы наблюдали, что клетки экспрессировали меньше K63-специфичных слияний DUB (AMSH-LP), чем слияния, экспрессирующие K48-специфические (OTUB1) или двойные специфические (UL36). DUBs (Fig. 2A), и этот образец также наблюдался в клетках HeLa (Fig. 2B). Однако это снижение экспрессии не оказало значительного влияния на эффективность рестрикции, поскольку все шесть слияний ограничивали инфекцию ВИЧ-1 как в клетках A549, так и в клетках HeLa (рис.2C и D). В клетках A549 каталитически неактивный OTUB1 * -RhTRIM5α был немного более пермиссивным к инфекции ВИЧ-1, тогда как в клетках HeLa каталитически неактивная конструкция AMSH * -LP-RhTRIM5α была немного более восприимчивой к инфекции, чем ее каталитически активный аналог.

Фиг. 2. Слитые белки

деубиквитиназа-RhTRIM5α ограничивают инфекцию ВИЧ-1. (A и B) Клетки A549 (A) и HeLa (B), трансдуцированные для экспрессии указанных слияний DUB-RhTRIM5α, собирали, и экспрессию слитого белка оценивали с использованием антитела против FLAG.(C и D) Равное количество клеток A549 (C) и HeLa (D), стабильно экспрессирующих разные слитые белки DUB-RhTRIM5α, инфицировали серийными разведениями репортерного вируса ВИЧ-1-GFP. Инфекционность оценивалась количественно путем измерения доли GFP-положительных (GFP + ) клеток проточной цитометрией при 48 hpi. (E и F) Клетки HeLa, трансдуцированные для экспрессии индуцибельных конструкций DUB и незакрепленный RhTRIM5α, инкубировали с / без доксициклина в течение 48 часов для оценки уровней экспрессии белка с помощью вестерн-блоттинга с анти-FLAG и анти-HA антителами (E) и для количественной оценки инфекционности. (F) как описано в легенде к панелям C и D.Приведенные здесь данные представляют как минимум три независимых эксперимента. вилка ед., условные единицы; Нетрансд, непереведенный.

Чтобы понять, являются ли незначительные изменения в уровнях рестрикции косвенными эффектами белков DUB, изменяющих клеточные пути, мы дважды трансдуцировали клетки HeLa, чтобы экспрессировать белки DUB в индуцибельной системе (рис. 2E) и стабильно экспрессировать меченный HA RhTRIM5α без какого-либо ДУБ-сплавы. Мы проверили ограничение RhTRIM5α при индукции экспрессии UL36, AMSH и OTUB1 и не наблюдали каких-либо изменений в переносимости инфекции (рис.2F).

Незначительные изменения в уровнях рестрикции слитых белков DUB-RhTRIM5α хорошо коррелируют с уровнями экспрессии. Тем не менее, поскольку все слитые белки были способны ограничивать инфекцию ВИЧ-1, мы пришли к выводу, что убиквитинирование не требуется для ограничения инфекции RhTRIM5α.

K63-связанная активность убиквитинирования необходима для ограничения обратной транскрипции с помощью TRIM5α. Известно, что во время рестрикции TRIM5α способствует разборке капсидов до завершения обратной транскрипции, хотя этот эффект отменяется в присутствии ингибитора протеасом MG132 (14, 16). Чтобы определить, требуется ли для ограничения обратной транскрипции активность убиквитинирования, и конкретно определить, какой тип убиквитиновых связей является критическим, мы инфицировали клетки A549 и HeLa, экспрессирующие слитые белки DUB-RhTRIM5α, репортерным вирусом ВИЧ-1 и измерили продукты обратной транскрипции ( Рис. 3A и B). Как и ожидалось, мы наблюдали минимальную продукцию продуктов обратной транскрипции в клетках, экспрессирующих RhTRIM5α, что согласуется с предыдущими сообщениями (2, 3), и наблюдали увеличение продуктов обратной транскрипции в клетках, экспрессирующих каталитически активный слитый белок HSV-1 UL36-деубиквитиназа. (UL36-RhTRIM5α) (38).

ФИГ. 3.

K63-связанная активность убиквитинирования необходима для ограничения обратной транскрипции с помощью TRIM5α. Клетки, стабильно экспрессирующие слитые белки DUB-RhTRIM5α, инфицировали репортерным вирусом ВИЧ-1, экспрессирующим GFP, и продукты обратной транскрипции вируса измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. (A) Количество продуктов обратной транскрипции (продукты поздней RT), накапливающихся в указанных клеточных линиях A549. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех технических повторений. (B) Продукты поздней ОТ оценивали на предмет вариаций вирусных разведений в клетках HeLa.Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех технических повторений. (C и D) Отношения продуктов RT активного DUB к таковым из его соответствующего каталитически неактивного контроля для клеток A549 (C) и HeLa (D) при различных вирусных концентрациях. Планки погрешностей представляют собой SEM биологических реплик. (E) Продукты ОТ, оцениваемые для клеток HeLa, трансдуцированных для экспрессии индуцибельных белков DUB и неслитого RhTRIM5α. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех технических повторений. (F) Соотношение продуктов поздней ОТ необработанных и обработанных доксициклином (No tx / Dox tx) клеточных линий.Планки погрешностей представляют собой SEM биологических реплик. Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа: ***, P <0,001; **, P <0,01; *, P <0,05; нс, не имеет значения.

Чтобы более точно определить связи убиквитинирования, которые имеют решающее значение для ограничения обратной транскрипции с помощью TRIM5α, мы измерили обратную транскрипцию в клетках, экспрессирующих K63-специфические (AMSH-LP-RhTRIM5α) или K48-специфические (OTUB1-RhTRIM5α) слитые белки деубиквитиназы. вместе с их каталитически неактивными элементами управления.Мы наблюдали обогащение продуктов обратной транскрипции, особенно в клетках A549, экспрессирующих каталитически активную K63-специфическую деубиквитиназу, AMSH-LP-RhTRIM5α, но не в клетках A549, экспрессирующих K48-специфический DUB (рис. 3A). Аналогичная картина была очевидна для ряда вирусных разведений в клетках HeLa (рис. 3B). Более того, это накопление было наиболее очевидно при сравнении соотношения продуктов обратной транскрипции в клетках, экспрессирующих активный DUB, с их соответствующими каталитически неактивными контролями (рис. 3C и D). В этом случае мы наблюдали обогащение продуктов обратной транскрипции в клетках, экспрессирующих дуально-специфические или K63-специфические слитые белки DUB, но не в клетках, экспрессирующих K48-специфические слитые белки. Это не было связано с неспецифическими эффектами экспрессии DUB, поскольку мы не наблюдали какого-либо увеличения вирусной обратной транскрипции в клетках, экспрессирующих RhTRIM5α, когда отдельные белки DUB экспрессировались как неслитые белки (рис. 3E и F).

Ингибирование K63-связанного убиквитинирования вызывает стабильную ассоциацию RhTRIM5α с ядрами ВИЧ-1, но нарушает ассоциацию с мембранами аутофагосом.Предыдущие исследования продемонстрировали, что включение ядер ВИЧ-1 с помощью RhTRIM5α приводит к быстрой потере флуоресцентного сигнала, связанного с вирусным ядром, но что обработка клеток ингибитором протеасомы MG132 или добавление деубиквитиназы UL36 к RhTRIM5α стабилизирует эти комплексы в цитоплазме ( 17, 38). Поэтому мы стремились определить, какой тип связи убиквитина стабилизировал цитоплазматические комплексы RhTRIM5α – ВИЧ-1, используя клетки A549, стабильно экспрессирующие специфичные по сцеплению слияния DUB-RhTRIM5α. В соответствии с предыдущими сообщениями, мы наблюдали минимальную стабильную ассоциацию между RhTRIM5α дикого типа и p24 ВИЧ-1 (рис. 4C), что согласуется с мнением, что RhTRIM5α быстро дестабилизирует вирусные ядра (17). Однако, когда K63-связанное убиквитинирование с помощью RhTRIM5α ингибируется, как в случае клеток, экспрессирующих UL36-RhTRIM5α и AMSH-LP-TRIM5α, мы наблюдали значительную стабильную совместную локализацию между TRIM5α и вирусным ядром, особенно при сравнении результатов для этих DUB и их каталитически неактивные регуляторы (рис.4A и C). Напротив, мы измерили минимальную стабильную совместную локализацию между K48-специфическим слитым белком DUB (OTUB1-RhTRIM5α) и p24 ВИЧ-1, и не было существенной разницы между результатами для каталитически активного и неактивного слияния (рис. 4C).

Рис. 4.

Совместная локализация слитых белков DUB, p24 ВИЧ-1 и / или YFP-LC3 в клетках A549. Клетки A549, экспрессирующие YFP-LC3 и указанные слитые белки RhTRIM5α-DUB, меченные Flag, были синхронно инфицированы репортерным вирусом ВИЧ-1. (B) Типичные изображения, изображающие совместную локализацию между Flag и ВИЧ-1 p24 (A) или Flag и YFP-LC3. (C) Степень совместной локализации между точкой RhTRIM5α (Flag) и ядром ВИЧ-1 (p24) была определена количественно для каждой из клеточных линий DUB-RhTRIM5α. Данные представлены как доля дважды положительных точек (p24 + Flag + ) от общего числа точек Flag. Планки погрешностей представляют собой SEM не менее 20 изображений, полученных для каждой линии клеток. Данные представляют из трех независимых экспериментов.(D) Степень колокализации между RhTRIM5α (Flag) puncta и YFP-LC3 (p24) была определена количественно для каждой из клеточных линий DUB-RhTRIM5α. Данные представлены как доля дважды положительных точек (LC3 + Flag + ) от общего числа точек Flag. Планки погрешностей представляют собой SEM не менее 20 изображений, сделанных для каждой линии клеток. Данные представляют из трех независимых экспериментов. Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа: ***, P <0,001; **, P <0. 01; нс, не имеет значения.

Мы также спросили, влияет ли ингибирование специфических связей убиквитина на способность RhTRIM5α связываться с аутофагическими белками, такими как LC3. С этой целью мы создали клеточные линии A549, стабильно экспрессирующие как LC3b (YFP-LC3), помеченный желтым флуоресцентным белком (YFP), так и каждый из слияния DUB-RhTRIM5α. LC3 локализуется на мембранах аутофагосом, и поэтому точки LC3 служат маркерами аутофагосом. После инфицирования ВИЧ-1 мы измерили степень совместной локализации между слияниями DUB-RhTRIM5α и YFP-LC3 (рис.4B и D).

Анализ совместной локализации TRIM5α-LC3 показал, что убиквитинирование, связанное с K63, также имеет решающее значение для ассоциации RhTRIM5α с YFP-LC3, поскольку как DUB-RhTRIM5α, так и AMSH-LP-TRIM5α показали минимальную совместную локализацию с LC3, в отличие от результатов для их каталитически неактивные аналоги (рис. 4B). В совокупности эти данные показывают, что ингибирование K63-связанного убиквитинирования вызывает стабильную ассоциацию между RhTRIM5α и ядрами HIV-1 и что K63-связанная активность убиквитинирования является критической для ассоциации TRIM5α с маркерной мембраной аутофагосомы LC3. Примечательно, что наблюдалась минимальная тройная совместная локализация между RhTRIM5α, LC3 и p24 (данные не показаны), это указывает на то, что аутофагический аппарат не задействован в стабилизированных комплексах ВИЧ-1-RhTRIM5α, когда K63-связанное убиквитинирование ингибируется.

Убиквитинирование, связанное с K63, необходимо для дестабилизации ядер ВИЧ-1 с помощью TRIM5α. Наше предыдущее исследование продемонстрировало, что добавление UL36 DUB к RhTRIM5α также предотвращает абортивную разборку ядра ВИЧ-1, используя биохимическую судьбу капсида (FOC ) проба (38).В этом анализе ядра вирусов осаждают из цитоплазматических экстрактов посредством центрифугирования, и можно оценить относительные количества осаждаемого капсида в клетках. Поэтому мы спросили, предотвращает ли ингибирование K63-связанного убиквитинирования способность RhTRIM5α дестабилизировать ядро ​​ВИЧ-1, приводя к увеличению соответствующего количества гранулируемого капсида в этих клетках. В соответствии с нашими анализами, основанными на визуализации, мы наблюдали, что клетки, экспрессирующие AMSH-LP-RhTRIM5α, содержат такое же количество гранулированного капсида, что и нетрансдуцированные контрольные клетки A549 (рис. 5), в то время как каталитически неактивная конструкция уменьшала количество гранулированного капсида после заражения, аналогично результатам для клеток, обработанных 10 мкМ PF74 (рис. 5), которые, как мы ранее показали, ускоряют снятие покрытия ядра ВИЧ-1 с использованием этого проба (42, 43). Эти данные демонстрируют, что способность RhTRIM5α вызывать абортивную разборку ядра ВИЧ-1 требует K63-связанного убиквитина. Более того, мы провели исследования на основе изображений для количественной оценки белков капсида в клеточных линиях, экспрессирующих слитые белки DUB.В условиях синхронизированного заражения мы наблюдали увеличение количества точек для клеточных линий, экспрессирующих UL36 (K63 и K48) и AMSH-LP-RhTRIMα (специфичный для K63) (рис. 5C), что подтверждает идею о необходимости убиквитинирования, связанного с K63, для вирусного разборка сердечника.

Рис. 5

Убиквитинирование, связанное с K63, необходимо для TRIM5α-опосредованной разборки ядер ВИЧ-1. (A и B) Клетки A549, экспрессирующие AMSH-LP / LP * -RhTRIM5α, были инфицированы ВИЧ-1, псевдотипированным VSV-G. Через восемь часов после инфицирования клетки собирали и интактные ядра выделяли ультрацентрифугированием через подушку из 50% сахарозы.(A) Входящие, растворимые и осаждаемые фракции оценивали на уровни p24 с помощью вестерн-блоттинга. Показанные результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (B) Относительные результаты денситометрии полос Вестерн-блоттинга для трех биологических повторов. (C) Клетки A549, экспрессирующие слитые белки с флагом RhTRIM5α-DUB, были синхронно инфицированы VSV-G-псевдотипом ВИЧ-1, и количество поверхностей p24 на клетку было количественно определено для 20 изображений. Планки погрешностей представляют SEM из трех биологических повторов.Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа: ***, P <0,001; **, P <0,01; нс, не имеет значения.

Убиквитинирование является критическим для ассоциации TRIM5α с p62 и мембранами аутофагосом. Затем мы попытались определить др. Клеточные детерминанты, необходимые для рекрутирования сборок RhTRIM5α в аутофагосомы. p62 / SQSTM1 (p62) представляет собой аутофагический адаптерный белок, который может связывать убиквитинированные субстраты и направлять их к аутофагосомам (44). Ранее мы определили, что p62 колокализуется с цитоплазматическими тельцами TRIM5α (36).Чтобы определить, требуется ли убиквитинирующая активность TRIM5α для его ассоциации с p62, мы измерили степень совместной локализации между различными гибридными белками TRIM5α, в частности, двойно-специфическими и K63-специфическими слияниями DUB-RhTRIM5α и p62 после заражения ВИЧ-1. Мы наблюдали, что в отсутствие активности убиквитинирования наблюдается значительно меньшая совместная локализация белков RhTRIM5α и p62 (рис. 6B), указывая тем самым, что активность убиквитинирования TRIM5α важна для его ассоциации с аутофагическими адапторными белками, такими как p62.Затем мы хотели определить, нуждается ли TRIM5α в белковом адаптере аутофагии, а именно p62, для его ассоциации с маркером аутофагической мембраны LC3. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали кластерное редактирование генома с регулярным расположением коротких палиндромных повторов (CRISPR) и CRISPR-ассоциированным белком 9 (Cas9) для нацеливания на p62 или не нацеливающую направляющую РНК (гРНК) в клетках A549, стабильно экспрессирующих YFP-LC3 (рис. 6C). ). Эти клетки впоследствии трансдуцировали для стабильной экспрессии RhTRIM5α или UL36 * -RhTRIM5α, учитывая, что это был слитый белок DUB, который наиболее эффективно колокализовался с YFP-LC3 (рис.4Б). Мы количественно оценили связь между RhTRIM5α и LC3 и наблюдали, что в отсутствие p62 колокализация между YFP-LC3 и RhTRIM5α значительно меньше (фиг. 6D). Взятые вместе, эти данные показывают, что TRIM5α требует активности убиквитинирования для его ассоциации с аутофагическим адаптерным белком p62 и что без p62 TRIM5α неспособен связываться с маркерной мембраной аутофагосомы LC3.

Рис. 6.

Убиквитинирование, связанное с K63, необходимо для ассоциации TRIM5α с p62 и мембранами аутофагосом.(A) Клетки A549, экспрессирующие указанные слитые белки с меткой Flag RhTRIM5α-DUB, были синхронно инфицированы репортерным вирусом ВИЧ-1. На 6 hpi была измерена степень колокализации между Flag и p62. (B) Колокализация количественно определяется как доля дважды положительных точек (p62 + Flag + ) от общего числа точек Flag. Планки погрешностей представляют собой SEM не менее 20 изображений, полученных для каждой линии клеток. Данные представляют из трех независимых экспериментов.Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа: ***, P <0,001; **, P <0,01; *, P <0,05. (C) Клетки A549 были лишены p62 посредством редактирования генома CRISPR-Cas9. Эти клетки впоследствии трансдуцировали для экспрессии YFP-LC3 и указанных конструкций DUB. Вестерн-блот показывает экспрессию слитого белка Flag (вверху), нокаута p62 (KO) (вторая панель), YFP-LC3 (третья панель) и контроля загрузки глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (внизу).(D) После инфицирования репортерным вирусом ВИЧ-1 измеряли степень совместной локализации между различными гибридными белками TRIM5α (помеченными флагом) и YFP-LC3. Планки погрешностей представляют собой SEM не менее 20 изображений, полученных для каждой линии клеток. Данные представляют из трех независимых экспериментов. Статистическую значимость определяли по критерию Стьюдента t : ***, P <0,001; *, P <0,05.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы использовали RhTRIM5α, конъюгированный с деубиквитинирующими ферментами, специфичными для K63- и K48-связанного убиквитина, чтобы проанализировать роль этих специфических убиквитиновых связей в антиретровирусных эффекторных функциях TRIM5α и его распознавание аутофагическими белками.Преимущество этого подхода заключается в том, что он специфически изменяет убиквитин-зависимые функции TRIM5α без серьезного нарушения путей клеточной деградации, как это происходит с фармакологическими ингибиторами или экспрессией пулов убиквитина, неспособных к специфическим связям убиквитина (т.е.убиквитин K48R или K63R).

Исследование RhTRIM5α, слитого как с K63-, так и с K48-специфическими DUB, проанализированное с помощью антител, специфичных для любого типа связи убиквитина, показало, что обе формы убиквитина могут быть конъюгированы с RhTRIM5α и что DUB, специфичные для этих связей, эффективно удаляют эти связи из RhTRIM5α (рис. 1), что свидетельствует о том, что убиквитин, связанный с K63 и K48, может быть конъюгирован с RhTRIM5α. Эти инструменты предоставили возможность исследовать роль каждого типа в связывании эффекторных функций TRIM5α и ассоциации с белками аутофагического пути.

Предыдущие исследования показали, что дестабилизация ретровирусных капсидов и ингибирование обратной транскрипции ВИЧ-1 белками TRIM5 чувствительна к ингибиторам протеасом, таким как MG132 (14, 16, 20), и одним из следствий этих наблюдений является то, что TRIM5α использует протеасомный аппарат для дестабилизации ретровирусных капсидов.Однако протеасомная деградация обычно связана с полиубиквитиновыми связями, связанными с K48, а не с K63 (21–23, 28–30), и наши результаты здесь показывают, что те же этапы рестрикции, которые чувствительны к ингибированию протеасом, также чувствительны к K63. -специфическая активность DUB (AMSH-LP) (рис. 3 и 4), но на нее не влияет добавление TRIM5α к K48-специфическому DUB (OTUB1). Примечательно, что пока рукопись находилась на пересмотре, статья Флетчера и др. наблюдали, что сборка TRIM5α вокруг чувствительных к рестрикции вирусных ядер запускает аутоубиквитинирование TRIM5α с помощью K63-связанного убиквитина, которое запускает протеасомную деградацию TRIM5α (45).Наши данные с использованием слияния DUB в этом исследовании полностью согласуются с такой неканонической функцией K63-связанного убиквитина, а также согласуются с нашим предыдущим наблюдением, что все аспекты ограничения TRIM5α нечувствительны к истощению ключевых медиаторов аутофагии Beclin1 и Atg5 (34). . Такая модель может также согласовать предыдущие исследования, которые наблюдают, что протеасомное ингибирование предотвращает TRIM5α-опосредованную разборку ядра (14, 17) и деградацию TRIM5α, наблюдаемую в ответ на насыщающие уровни рестрикционно-чувствительного вируса (19).

В этом исследовании мы также наблюдали, что связанный с K63 убиквитин может приводить к рекрутированию аутофагических белков, таких как LC3 и p62 (Fig. 4 и 6). Поскольку наши предыдущие исследования показывают, что эти события отделимы от этапов рестрикции ретровирусов (34), как описано выше, кажется вероятным, что аутофагическое рекрутирование сборок TRIM5α играет роль в др. Аспектах функции TRIM5α. В этом отношении ряд исследований продемонстрировал, что сборка TRIM5α может запускать активацию врожденного иммунитета способом, который также зависит от цепей полиубиквитина, связанных с K63, которые могут индуцировать экспрессию генов, приводящую к антивирусному состоянию (13, 45, 46). ).Мы предполагаем, что аутофагическое распознавание сборок TRIM5α обеспечивает тонкую настройку таких сигнальных сборок.

Поскольку известно, что TRIM5α способен к аутоубиквитинизации in vitro (12, 47), кажется вероятным, что наблюдаемые нами паттерны и зависимости убиквитинирования связаны с аутоубиквитинизацией TRIM5α, хотя мы не можем исключить возможность того, что происходит некоторое убиквитинирование TRIM5α. через другую неопознанную клеточную убиквитинлигазу. Идея о том, что аутоубиквитинирование отвечает за наблюдаемые эффекты, также подтверждается недавним исследованием Fletcher et al.(45).

Таким образом, эти исследования демонстрируют, что способность TRIM5α индуцировать разборку капсида ВИЧ-1 во время рестрикции и ингибировать обратную транскрипцию зависит от генерации K63-связанного убиквитина с помощью TRIM5α (Рис. 7). Точно так же способность связываться с аутофагосомами зависела как от K63-связанного убиквитинирования, так и от аутофагического адаптера p62, хотя наши предыдущие исследования доказывают, что разборка капсида и ингибирование обратной транскрипции не зависят ни от p62 (36), ни от аутофагических эффекторов (34). ).Это исследование также устанавливает инструменты, которые можно использовать для исследования роли связывания специфической конъюгации убиквитина в клеточной функции других убиквитинлигаз.

Рис. 7

Современные представления о механизме рестрикции ретровирусов с помощью TRIM5α. (A) Во время инфекции ретровирусы обратно транскрибируют свой геном РНК (розовый) в ДНК (фиолетовый), снимают оболочку со своего капсида (CA) (синий) и направляются в ядро ​​для интеграции. (B) TRIM5α (красные блоки) существует как диффузный белок и цитоплазматические тельца, которые колокализуются с аутофагосомами (зеленые кружки).При ретровирусной инфекции TRIM5α образует скопления вокруг капсида, чего достаточно для подавления инфекции (C). (D) K63-специфическая убиквитинлигазная активность TRIM5α является критической для его ассоциации с мембранными маркерами аутофагосом и его способности дестабилизировать вирусные ядра до завершения обратной транскрипции. В отсутствие активности K63-специфической убиквитинлигазы, TRIM5α образует стабильную ассоциацию с капсидом, позволяя протекать обратной транскрипции; однако заражение все еще заблокировано.Это благоприятствует модели, согласно которой образование сборки TRIM5α вокруг капсида достаточно для подавления инфекции, тогда как активность убиквитинлигазы TRIM5α необходима для ингибирования обратной транскрипции. RT, обратная транскриптаза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки и фармацевтические препараты. Клеточные линии HeLa, HEK293T и A549, используемые в этом исследовании, были получены из Американской коллекции типовых культур. Клеточные линии HeLa, HEK293T и A549 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Atlanta Biologicals), 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10 мкг / мл. ципрофлоксацин.

Клонирование и создание стабильных клеточных линий. Генерацию слитых белков деубиквитиназы (DUB) RhTRIM5α выполняли, как описано ранее (38). Вкратце, каталитически активные и неактивные ферменты DUB, использованные в этом исследовании, были следующими: HSV-1 UL36 DUB (остатки с 15 по 260) (38, 40), AMSH-LP (остатки с 265 по 436, любезный подарок лаборатории Фукаи. , University of Tokyo) (48) и OTUB1 (любезный подарок лаборатории Wade Harper [плазмида номер 22551; Addgene]; мутация описана в таблице 1 ссылки 49).Каждый из этих DUB был клонирован во фрейме в pLVX Flag-RhTRIM5α, между тегом Flag и короткой линкерной последовательностью перед стартовым кодоном RhTRIM5α, с использованием сплайсинга посредством ПЦР с выступающим удлинением (SOE). Для индуцируемой экспрессии конструкций DUB помеченный флагом UL36 (остатки с 15 по 260) (38, 40), AMSH-LP (остатки с 265 по 436) и OTUB1 клонировали в рамке считывания в плазмиду pLKOΔ-IP (разновидность подарок из лаборатории Поля Биениаса) (50).

Для создания стабильных клеточных линий лентивирус был получен путем трансфекции равных количеств гликопротеина вируса везикулярного стоматита (VSV-G), psPAX2 (от Didier Trono, NIH AIDS Reagent Program [каталожный номер 11348]) (51) и pLVX- DUB-RhTRIM5α или pLKOΔ-DUB в клетки HEK293T.Вирусный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали через фильтры 0,45 мкм (Millipore) и наносили на клетки HeLa или A549. Через 48 часов после трансдукции к клеткам добавляли пуромицин, и после отбора клетки собирали для фенотипического анализа.

Стабильная экспрессия YFP-LC3- или HA-меченного RhTRIM5α была достигнута путем клонирования YFP-LC3- или HA-меченного RhTRIM5α, как описано ранее (52), в ретровирусный вектор (53) EXN, продуцирующий EXN YFP-LC3 или RhTRIM5α . Для создания стабильных клеточных линий ретровирус получали путем трансфекции равных количеств VSV-G, упаковывающей плазмиды pCigB и EXN YFP-LC3 или RhTRIM5α в клетки HEK293T.Вирусный супернатант собирали, как описано выше, и наносили на клетки A549 или HeLa. Через сорок восемь часов после трансдукции к клеткам добавляли G418 и после отбора клетки собирали для фенотипического анализа.

нокаут p62 / SQSTM1 Клеточные линии A549 были созданы с использованием модифицированной версии LentiCRISPRv2 (плазмида Addgene номер 52961, подарок Фэн Чжан) (54), в которой кассета устойчивости к пуромицину была заменена кассетой устойчивости к гигромицину, продуцирующей LentiCRISPRycinv2-Hygromycin .Последовательности направляющих РНК были созданы с использованием инструмента проектирования CRISPR на http://www.crispr.mit.edu. Следующие олигонуклеотиды были отожжены и клонированы в LentiCRISPRv2-гигромицин: 5'-CACCGTGAAACACGGACACTTCGGG-3 ', нацеленный на p62 / SQSTM1, и 5'-CACCGGCACTACCAGAGCTAACTCA-3', нацеленный на контрольную последовательность. Лентивирус получали путем трансфекции равных количеств VSV-G, psPAX2 (от Didier Trono, NIH AIDS Reagent Program [каталожный номер 11348]) (51, 55) и LentiCRISPRv2-гигромицина (содержащего интересующую направляющую РНК) в клетки HEK293T. Сбор вирусного супернатанта, трансдукцию и отбор стабильных клеточных линий выполняли, как описано выше.

Создание и количественная оценка репортерного вируса. Репортерный вирус ВИЧ-1 получали, как описано ранее (36). Вкратце, репортерный вирус ВИЧ-1 был получен путем трансфекции полиэтиленимином (56) клеток HEK293T, высеянных в 25-сантиметровые планшеты для культивирования тканей 10 мкг VSV-G и 15 мкг провирусной конструкции R7ΔEnvGFP, в которой ген Nef был заменен зеленый флуоресцентный белок (GFP).Репортерный вирус собирали, как описано выше и ранее (57). Титрование репортерного вируса проводили с использованием количественной ПЦР (qPCR) в реальном времени, анализа обратной транскрипции (RT) (PERT) с усилением продукта с SYBR Green I (SG-PERT), как описано ранее (55). Вкратце, лизированный вирусный супернатант инкубировали с РНК MS2 (номер продукта 10165948001; Sigma-Aldrich), и полученные продукты обратной транскрипции количественно определяли с помощью RT-qPCR с использованием SYBR green (номер по каталогу 1725124; Bio-Rad).

Анализ убиквитинирования in vitro и вестерн-блоттинг. Клетки HEK293T культивировали, как описано выше, и трансфицировали равными количествами конструкции pLVX-DUB или DUB * -RhTRIM5α и плазматического убиквитина (HA-Ub), экспрессирующего ДНК, меченного гемагглютинином. как описано ранее (58). Клетки собирали через 48 часов после трансфекции и дважды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS). Их лизировали в трис-буферном физиологическом растворе (TBS) с добавлением 1% Triton X-100, 0,1% IGEPAL и коктейля ингибиторов протеазы (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США) на льду в течение 30 минут и центрифугировали в течение 15 минут. 13000 × г для остатков гранулированных клеток.Супернатант фильтровали через фильтр 0,22 мкм и получали прозрачные лизаты. Уровни экспрессии слитых белков и HA-Ub оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Содержание белка в лизатах цельных клеток определяли количественно с использованием набора для анализа белков бицинхониновой кислоты (BCA) (Thermo Fischer) и равных количеств белка, кипяченных с буфером для образцов Laemmli 2 × SDS в течение 5 мин. Их загружали в предварительно отлитый полиакриламидный гель для SDS-PAGE (Mini-Protean TGX; Bio-Rad) и разделяли электрофорезом.Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны и определяли инкубацией со следующими антителами: антитело против НА (клон 3F10), конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США) и антитело против Flag M2-HRP ( номер продукта A8592; Sigma). Лизаты клеток, содержащие эквивалентные количества слитых белков DUB и Ha-Ub, использовали для иммунопреципитации (IP). IP проводили с использованием антитела против Flag, конъюгированного с магнитными шариками (антитело против Flag M2, номер продукта M8823; Sigma) для селективного концентрирования слитых белков, меченных Flag.Концентрированные белки элюировали невосстанавливающим буфером для образцов SDS-PAGE путем кипячения в течение 3 минут. Статус убиквитинирования оценивали с помощью вестерн-блоттинга с антителами против HA, против Flag и противубиквитина (специфичные для связывания K48 или K63, каталожные номера 179434 и 140601; Abcam).

Количественное определение продуктов обратной транскрипции. Продукты обратной транскрипции вирусов количественно определяли, как описано ранее (16). Вкратце, ДНК экстрагировали из клеток, инфицированных репортерным вирусом R7ΔEnvGFP, через 24 часа после инфицирования (hpi) с использованием набора для крови и тканей Qiagen DNeasy (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.Впоследствии ДНК определяли количественно, и равные количества ДНК переваривали с помощью DpnI (New England Biolabs). Продукты обратной транскрипции количественно оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием SYBR green (номер в каталоге 1725124; Bio-Rad) и следующих праймеров: GFP-FWD, 5'-CAACAGCCACAACGTCTATATCAT-3 '; GFP-REV, 5'-ATGTTGTGGCGGATCTTGAAG-3 '; GAPDH-FWD, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; и GAPDH-REV, 5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3 '.

Инфекционная и иммунофлуоресцентная микроскопия. Клеткам А549 и HeLa позволяли прилипать к обработанным фибронектином стеклянным покровным стеклам, помещенным в лунки 24-луночного планшета. Синхронизированное инфицирование проводили путем спинокуляции репортерного вируса на клетки при 13 ° C в течение 2 часов при 1200 × г , после чего вирусосодержащую среду удаляли и заменяли теплой средой. Клетки, содержащие покровные стекла, инкубировали при 37 ° C в течение 6-8 часов и затем фиксировали 3,7% формальдегидом (Polysciences) в 0,1 M PIPES [пиперазин- N , N '-бис (2-этансульфоновая кислота)], pH 6,8. Клетки были проницаемы с помощью 0,1% сапонина, 10% нормальной ослиной сыворотки, 0.01% азид натрия в PBS. Мы использовали следующие первичные антитела: кроличьи анти-Flag (номер продукта F1804; Sigma-Aldrich), мышиные анти-ВИЧ-1 p24 (каталожный номер sc-69728; Santa Cruz), кроличьи анти-p62 / SQSTM1 (каталожный номер 7695S; Cell Signaling) и мышиные антитела против p62 / SQSTM1 (каталожный номер sc-28359; Santa Cruz). Первичные антитела метили конъюгированными с флуорофором ослиными антимышиными или кроличьими антителами (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. , West Grove, PA, USA). Изображения были получены с помощью микроскопа DeltaVision (Applied Precision, Issaquah, WA, USA), оснащенного цифровой камерой (CoolSNAP HQ; Photometrics, Tucson, AZ, США), с использованием 1.Объектив с 4-кратной числовой апертурой (NA) 100 × и деконволюция с помощью программного обеспечения SoftWoRx (Applied Precision, Issaquah, WA, USA).

Анализ изображений. Для каждой клеточной линии в каждом эксперименте получали от 20 до 30 изображений z-стека с использованием идентичных параметров сбора данных. Деконволюционные изображения анализировали с помощью программного обеспечения Imaris (Bitplane). Для анализа колокализации между Flag-RhTRIM5α или гибридными белками DUB и маркерами, указанными на рисунках, был разработан алгоритм для создания трехмерной поверхности вокруг интересующего сигнала (Flag) и, следовательно, максимальной интенсивности флуоресценции, связанной с другие интересующие каналы были измерены.Алгоритм применялся ко всем изображениям в рамках данного эксперимента. Колокализация была определена как присутствие интенсивности сигнала выше фона, присутствующего на поверхности, и один и тот же порог колокализации поддерживался для данного канала для всех изображений в конкретном эксперименте. Графические и статистические расчеты были выполнены в Prism (GraphPad Software, Inc.). Как показано на каждом графике, показанном на фигурах, данные представлены как средние значения и стандартные ошибки средних (SEM), а значимость определялась с помощью теста Стьюдента t или дисперсионного анализа (ANOVA), как указано в условных обозначениях.

Судьба капсидного анализа. Судьба капсидного анализа была выполнена, как описано ранее (3, 59, 60). Клеточные линии инфицировали в течение 8 часов, отделяли проназой в течение 5 минут на льду и промывали 3 раза ледяным PBS. Осадки клеток ресуспендировали в гипотоническом буфере (10 мМ трис-HCl, pH 8, 10 мМ KCl, 1 мМ EDTA) и инкубировали в течение 15 минут на льду. Клетки лизировали в гомогенизаторе Dounce на 7,0 мл с пестиком B. Клеточные остатки очищали центрифугированием в течение 3 минут при 3000 об / мин. Очищенный лизат наслаивали на подушку из сахарозы 50% (мас. / Об.) В 1 × PBS и центрифугировали при 100000 × g в течение 2 часов при 4 ° C в роторе Beckman SW41.Исходные, растворимые и осадочные фракции анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против ВИЧ-1 p24.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа поддержана грантом № R01 GM123538, предоставленным E.M.C. S.I. был поддержан грантом номер T32 AI007508 Кэтрин Найт. F.D.-G. и, как. были поддержаны грантом № AI087390.

СНОСКИ

    • Получено 3 апреля 2019 г.
    • Принято 24 апреля 2019 г.
    • Принятая рукопись размещена в Интернете 8 мая 2019 г.
  • Авторские права © 2019 Американское общество микробиологии.

121 K 63 E 486265 220 В / 50 Гц КАТУШКА ЛЮЦИФЕРА | ГАЗОЙЛЬ

Стоимость доставки будет рассчитана и применена автоматически в процессе продажи (оформления заказа), прежде чем перейти к оплате.

ДОСТАВКА НИЖЕ 20 КГ:

  • Экспресс-Сервис: «Доставка до 10 часов утра» без дополнительных затрат.Просмотреть подходящие местоположения.
  • Экспресс-сервис 14 часов для всех других отправлений (материковая часть Испании и Португалии) менее 20 кг.

  • Круглосуточное обслуживание: Балеарские острова и Андорра, менее 20 кг.

ПЕРЕВОЗКИ БОЛЕЕ 20 КГ:

  • 24/48 часовое обслуживание для отправлений на материковую часть Испании и Португалии - более 20 кг.

  • Круглосуточное обслуживание: Балеарские острова и Андорра.


Сервис 3-5 рабочих дней Европейский стандарт для отправлений во Францию ​​и Германию весом до 35 кг.
Доставка в другие регионы, кроме Пиренейского полуострова, Балеарских островов, Франции и Германии на условиях Exworks.

Дополнительный автоматический выключатель Eaton Moeller FAZ-K63 / 3

Дополнительный автоматический выключатель Eaton Moeller FAZ-K63 / 3

UL 1077 Дополнительные защитные устройства для DIN-рейки


Кривая K (8–12X I n номинальный ток)
Расчетные индуктивные нагрузки

63 Ампер


Eaton FAZ-K63 / 3 Технические характеристики PDF
1.10 МБ

ПРИМЕЧАНИЕ. В Северной Америке эти коммутаторы признаны UL и сертифицированы CSA в качестве дополнительных устройств защиты. Согласно замыслу NEC (Национальный электротехнический кодекс), статья 240 и CEC (Канадский электротехнический кодекс), часть 1 C22. 1, дополнительные автоматические выключатели не могут использоваться в качестве замены устройства защиты параллельной цепи. Их можно использовать для обеспечения максимальной токовой защиты в приборе или другом электрическом оборудовании, где максимальная токовая защита параллельной цепи уже предусмотрена или не требуется.

ПРИМЕЧАНИЕ. Эти выключатели доступны по специальному заказу и могут потребовать дополнительных сроков поставки.

Выбор продукции
Кривая FAZ K (номинальный ток 8–12X I n )

  • - Разработано для двигателей, трансформаторов и вышестоящей электроники
  • - Время реакции мгновенного отключения: 8–12X I n номинальный ток
  • - признано UL и сертифицировано CSA в качестве дополнительных средств защиты
  • - Для международного и внутреннего использования (согласно IEC 60947-2)
  • - Номер файла UL 177451

Подходит для применений, где ожидаются средние уровни пускового тока. Мгновенное отключение составляет 8–12X номинал устройства (I n ). Применения включают небольшие трансформаторы, освещение, пилотные устройства, цепи управления и катушки. Средняя магнитная точка срабатывания.


Обзор продукта
Оптимальное качество продукции, проверенная надежность и безопасность обеспечивают лучшую защиту персонала, оборудования и оборудования. Автоматический выключатель Eaton FAZ-NA, устанавливаемый на DIN-рейку, разработан для использования в филиалах.

Описание приложения

  • - Дополнительная защита
  • - Цепи управления
  • - Освещение
  • - Торговое оборудование
  • - Бытовая техника

Мощное предложение для производителей машин и систем
FAZ доступен с характеристиками B, C, D, K, S и Z в соответствии с UL 1077, CSA C22. 2 № 235 и IEC 60947-2. Эти устройства имеют маркировку CE.

Сертификаты

Характеристики

  • - Полный спектр признанных UL 1077 миниатюрных автоматических выключателей на DIN-рейку с номинальным током до 63 А
  • - Стандартные номиналы от 10 kAIC до 277/480 Vac
  • - Конструкция с ограничением тока обеспечивает быстрое прерывание при коротком замыкании, что снижает пропускаемую энергию, которая может привести к повреждению цепи
  • - Подходит для дополнительной защиты
  • - Термомагнитная максимальная токовая защита
  • - Шесть уровней защиты от короткого замыкания, классифицированные по кривым B, C, D, K, S и Z
  • - Конструкция без расцепления - выключатель нельзя отключить, удерживая ручку в положении ВКЛ.
  • - Невыпадающие винты нельзя потерять
  • - Соответствует UL 1077, CSA C22. 2 № 235, а также стандарт IEC 60947-2
  • - Независимый расцепитель и вспомогательный выключатель, устанавливаемые на месте, последующий монтаж
  • - Ширина модуля всего 17,7 мм (на полюс)
  • - Индикатор положения контактов (красный / зеленый)
  • - Простая установка на DIN-рейку
  • - Возможность фиксации переключателя в положении ВКЛ или ВЫКЛ


Позвольте нашим опытным специалистам по продажам помочь вам в выборе продуктов, соответствующих вашим потребностям.ЗВОНИТЕ 866-595-9616.

© 2016 KMParts.com, Inc. Все права защищены.

TRIM25 способствует активации NF-κB, индуцированной TNF-α, за счет усиления K63-связанного убиквитинирования TRAF2

% PDF-1. 4 % 1 0 obj > endobj 4 0 obj > поток doi: 10.4049 / jimmunol.12application / pdf

  • TRIM25 Стимулирует TNF-α-индуцированную активацию NF-κB за счет усиления K63-связанного убиквитинирования TRAF2
  • 10.4049 / джиммунол.12 http://dx.doi.org/10.4049/jimmunol.122020-02-05false10.4049/jimmunol.12
  • http://www.jimmunol.org
  • http://www.jimmunol.org
  • 10.4049 / jimmunol.122020-02-05false
  • http://www.jimmunol.org
  • 2020-02-05T01: 48: 01 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / W Unicode2021-02-23T10: 49: 35-08: 002021-02-23T10: 49: 35-08: 00 Acrobat Distiller 10.0.0 (Windows) uuid: a79162f9-1dd1-11b2-0a00-f5d9500uuid: 6a06d05c-1dd2-11b2-0a00-d30078c287ff конечный поток endobj 3 0 obj > endobj 2 0 obj > endobj 151 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> endobj 5 0 obj > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Thumb 15 0 R / Type / Page >> endobj 6 0 obj > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Thumb 28 0 R / Type / Page >> endobj 7 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 31 0 R / Type / Page >> endobj 8 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 34 0 R / Type / Page >> endobj 9 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 37 0 R / Type / Page >> endobj 10 0 obj > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 40 0 ​​R / Type / Page >> endobj 11 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 43 0 R / Type / Page >> endobj 12 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 46 0 R / Type / Page >> endobj 13 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Thumb 49 0 R / Type / Page >> endobj 187 0 объект [190 0 R] endobj 188 0 объект > поток HW] w۸} У1 0oN & ٤X4-H-? ⺿ wf @ Js \] ϊn ߬ + o1. OA & zV_ ~ Plo'2 ݇ HEw & + j3t 藟 $ "(> sJ {! - teͦ

    TRIM25 усиливает противовирусное действие цинк-пальцевого противовирусного белка (ZAP).

    Abstract

    Фактор хозяина и ген, стимулируемый интерфероном (IFN) (ISG) ) продукт, противовирусный белок с цинковыми пальцами (ZAP), подавляет ряд различных вирусов, узурпируя и пересекаясь с множеством клеточных путей. Чтобы выяснить его противовирусный механизм, мы проводим скрининг РНКи с потерей функции по всему геному для выявления клеточных кофакторов. необходим для антивирусной активности ZAP против прототипа альфавируса, вируса Синдбис (SINV).Чтобы исключить нецелевые эффекты, мы проводим строгие подтверждающие анализы для проверки лучших результатов. Выявленные важные партнеры по взаимодействию с ZAP включают белки, участвующие в проницаемости мембран для ионов, передаче сигналов IFN типа I и посттрансляционной модификации белка. Фактором, вносящим наибольший вклад в противовирусную функцию ZAP, является TRIM25, убиквитин E3 и лигаза ISG15. Мы демонстрируем здесь, что TRIM25 взаимодействует с ZAP через домен SPRY, а мутанты TRIM25, лишенные домена RING или coiled-coil, неспособны стимулировать противовирусную активность ZAP, предполагая, что как активность лигазы TRIM25, так и его способность образовывать олигомеры являются критическими для его кофакторной функции.TRIM25 увеличивает модификацию как короткой, так и длинной изоформ ZAP с помощью K48- и K63-связанного полиубиквитина, хотя убиквитинирование ZAP не влияет напрямую на его противовирусную активность. Однако TRIM25 имеет решающее значение для способности ZAP ингибировать трансляцию входящего генома SINV. Взятые вместе, эти данные раскрывают TRIM25 как истинный кофактор ZAP, который ведет к усилению модификации ZAP, усиливая его активность ингибирования трансляции.

    Многие научные публикации, созданные UC, находятся в свободном доступе на этом сайте из-за политики открытого доступа UC.Сообщите нам, насколько этот доступ важен для вас.

    Основное содержание

    Загрузить PDF для просмотраПросмотреть больше

    Дополнительная информация Меньше информации

    Закрывать

    Введите пароль, чтобы открыть этот PDF-файл:

    Отмена Ok

    Подготовка документа к печати…

    Отмена

    Для индукции аутофагии в атрофических мышечных клетках требуется активация ULK1 с помощью TRIM32 через неякоренные цепи полиубиквитина, связанные с K63

    ВВЕДЕНИЕ

    Аутофагия - это катаболический процесс, который обеспечивает удаление избыточных или поврежденных клеточных компонентов в физиологических и патологических условиях и обеспечивает метаболизм при внеклеточном питательные вещества в дефиците ( 1 , 2 ). Защищая внутриклеточную среду от вредных веществ, аутофагия играет ключевую защитную роль при некоторых заболеваниях человека ( 3 ). Наследственные миопатии являются одними из наиболее задокументированных примеров тесной взаимосвязи между нарушением регуляции аутофагии и человеческими расстройствами ( 4 ). Дефектная аутофагия наблюдалась при миопатиях, связанных с коллагеном VI, мышечной дистрофии Дюшенна и мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, в то время как нарушение распознавания грузов аутофагии присутствует в мышечной дистрофии конечностей-пояса (LGMD) 1D и миофибриллярной миопатии 9023 4 7 , 5 ).Напротив, избыточная активация аутофагии характерна для мерозин-дефицитной врожденной мышечной дистрофии 1А ( 6 ).

    Клеточные изменения, вызванные нарушением регуляции аутофагии в мышцах, включают наличие поврежденных митохондрий и увеличенного эндоплазматического ретикулума, нарушение обмена саркомерных белков и повышенную восприимчивость к гибели клеток ( 5 ). Восстановление соответствующих уровней аутофагии с помощью фармакологических или диетических подходов сглаживает миопатические дефекты в моделях мышей для связанных с коллагеном VI и мышечной дистрофии Дюшена, обеспечивая доклинические доказательства значимости дисфункциональной аутофагии при этих заболеваниях ( 7 - 9 ).Эти исследования также выявили существование сигнальных путей, которые связывают аутофагию с правильным функционированием компартментов мышечных клеток, таких как внеклеточный матрикс (через коллаген VI и ламинин-2), взаимодействие цитоскелета с плазматической мембраной (дистрофин) и ядерное взаимодействие. конверт (ламинат A / C) ( 4 ). Однако механизмы, с помощью которых эти сигналы сходятся к аппарату аутофагии, чтобы модулировать его активность, остаются неизвестными.

    Трехчастный мотив, содержащий 32 (TRIM32), является членом семейства белков TRIM, большой группы убиквитинлигаз E3, характеризующихся наличием домена пальца RING, домена B-бокса, области спиральной спирали и вариабельная С-концевая область ( 10 ). Домены NHL характеризуют С-конец TRIM32, которые участвуют в димеризации белков и распознавании субстратов ( 11 ). Мутации в доменах NHL TRIM32 являются причиной LGMD2H и саркотубулярной миопатии, которые являются легкими и тяжелыми проявлениями одного и того же заболевания ( 12 ). Как trim32, нокаут (KO), так и нокаутные мыши, несущие ассоциированную с заболеванием мутацию, подтвердили миопатический фенотип как следствие дисфункции TRIM32 ( 13 , 14 ) и подчеркнули наличие неврологических дефектов, которые могут также способствуют мышечному расстройству ( 13 ).Миссенс-мутация в B-бокс-домене TRIM32 вызывает синдром Барде-Бидля типа 11, заболевание, характеризующееся ожирением, дегенерацией сетчатки, пороками развития мочеполовых путей и когнитивными нарушениями, но без мышечных изменений ( 15 ). В соответствии с этим наблюдением, TRIM32 также играет роль в регуляции процессов, не связанных напрямую с функцией мышц, таких как иммунитет, нейронная дифференцировка и рак ( 16 ).

    Как мутации TRIM32 вызывают мышечную дистрофию, полностью не выяснено.Профилактическая роль TRIM32 изначально постулировалась на основании его способности убиквитинировать актин, тропомиозин, тропонины, α-актинин и десмин ( 17 , 18 ). TRIM32 также ингибирует путь выживания фосфатидилинозитол-3-киназы / Akt за счет деградации десмосомного компонента плакоглобина ( 19 ). Исследования на мышах Trim32 KO показали, что TRIM32 не является необходимым для запуска атрофии мышц, но он играет ключевую роль в возобновлении роста мышц после атрофии ( 20 ).Этот результат согласуется с наблюдением, что пациенты с LGMD2H часто демонстрируют потерю моторики после длительной иммобилизации ( 21 ). Нарушение регенерации мышц также наблюдали у мышей Trim32 KO при повреждении, вызванном обработкой кардиотоксином ( 22 ). Нарушение роста мышц после атрофии приписывают нарушенной деградации PIAS4, лигазы SUMO (малый убиквитин-подобный модификатор), которая вызывает преждевременное старение ( 20 ), и ингибитора пролиферации NDRG2 ( 23 ). Еще предстоит выяснить, играет ли TRIM32 защитную роль в дифференцированных мышечных клетках во время или после индукции атрофии.

    Недавно было продемонстрировано, что несколько членов семейства белков TRIM способствуют индукции аутофагии за счет взаимодействия с вышестоящими регуляторами ULK1 (Unc-51, подобная киназе, активирующей аутофагию 1) и BECLIN 1 ( 24 - 27 ). Кроме того, белки TRIM действуют как рецепторы груза для избирательной аутофагии ( 27 - 29 ).

    AMBRA1 (активирующая молекула в BECN1-регулируемом белке аутофагии 1) является позитивным регулятором аутофагии, который связывает и регулирует активность BECLIN 1 и ULK1 ( 30 - 33 ), способствуя их неразрушающему убиквитинированию. Кроме того, AMBRA1 взаимодействует с убиквитин-лигазами E3 CULLIN4 и CULLIN5 ( 34 ), чтобы регулировать временную динамику реакции аутофагии и, с PARKIN и HUWE1, способствовать митофагии ( 35 , 36 ). Доказательства роли AMBRA1 в гомеостазе мышц появились недавно ( 37 ).Удаление AMBRA1 у рыбок данио приводит к тяжелой миопатии, характеризующейся дезорганизацией миофибрилл и аберрантной морфологией митохондрий ( 37 ). Аномальная организация мышечной структуры наблюдалась также у эмбрионов мутантных мышей AMBRA1 ( 37 ). Здесь мы показываем, что AMBRA1 взаимодействует с TRIM32 и опосредует индукцию аутофагии в мышечных клетках в атрофических условиях, стимулируя активность ULK1 с помощью незакрепленного K63-связанного полиубиквитина.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    AMBRA1 взаимодействует с убиквитинлигазой E3 TRIM32

    AMBRA1 был обнаружен в ассоциации с TRIM32 при скрининге взаимодействия белков на основе масс-спектрометрии ( 34 ).Связывание между AMBRA1 и TRIM32 было подтверждено коиммунопреципитацией в 293 Т-клетках, экспрессирующих белки MYC-AMBRA1 и FLAG-TRIM32 (фиг. 1A), и в миобластных клетках C2.7 на эндогенных уровнях (фиг. 1B). Домены AMBRA1 и TRIM32, ответственные за их взаимодействие, были картированы с помощью делеционных мутантов. Эксперименты по коиммунопреципитации на 293 Т-клетках, трансфицированных векторами, кодирующими N-концевую, центральную или C-концевую область AMBRA1, показали, что TRIM32 предпочтительно связывается с C-концевой частью AMBRA1 (рис.1С). С другой стороны, эксперименты по коиммунопреципитации на TRIM32 KO 293 Т-клетках, трансфицированных мутантами TRIM32, кодирующими каталитический домен (RING / B-бокс), домен спиральной спирали или повторы NHL, показали, что каталитический домен TRIM32 является ответственным за для привязки к Ambra1 (рис. 1D).

    Рис. 1 TRIM32 связывается с AMBRA1.

    ( A ) Белковые экстракты Т-клеток 293, трансфицированных MYC-AMBRA1– и FLAG-TRIM32, подвергали иммунопреципитации (IP) с использованием антитела против FLAG.Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против MYC и TRIM32. ( B ) Недифференцированные и дифференцированные клетки C2.7 лизировали, и белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против TRIM32. Неродственное антитело использовали в качестве отрицательного контроля (IP Ctr). Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против AMBRA1 и против TRIM32. ( C ) 293 Т-клетки котрансфицировали векторами, кодирующими HA-TRIM32 и следующие конструкции MYC-AMBRA1: полноразмерные (FL), N-концевые (аминокислоты с 1 по 532), центральные (аминокислоты с 533 по 751), и С-концевую область (аминокислоты с 767 по 1269).Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против MYC. Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против НА и против MYC. Показана схема архитектуры домена AMBRA1 (P-богатый, богатый пролином домен; S-богатый, богатый серином домен; Bh4, домен с гомологией Bcl2 3). Красная полоса указывает на домен, взаимодействующий с TRIM32. Звездочки указывают полосы AMBRA1 с ожидаемыми молекулярными массами. ( D ) TRIM32 KO 293 Т-клетки котрансфицировали векторами, кодирующими MYC-AMBRA1 и следующие конструкции FLAG-TRIM32: полноразмерный, каталитический домен (RING / B-бокс, аминокислоты от 1 до 136), центральная область, содержащая домен спиральной спирали (аминокислоты 136–326) и повторы NHL (аминокислоты 327–653). Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против FLAG. Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против FLAG и против MYC. Показана схема доменной архитектуры TRIM32 (CC, coiled-coil domain). Красная полоса указывает на домен, взаимодействующий с AMBRA1.

    TRIM32 необходим для индукции аутофагии атрофическими стимулами

    Взаимодействие TRIM32 с AMBRA1 побудило нас проанализировать роль TRIM32 в регуляции аутофагии в мышечных клетках.Мы провели эксперименты на мышиной линии миобластов (клетки C2.7), которая способна дифференцироваться в мышечные трубки при изъятии сыворотки. Сначала мы спросили, необходимы ли AMBRA1 и TRIM32 для поддержания базовой аутофагии в недифференцированных и дифференцированных клетках. Мы измерили поток аутофагии в клетках, в которых экспрессия AMBRA1 или TRIM32 была подавлена ​​с помощью специфических лентивирусных коротких шпилечных РНК (shRNA; shAmbra1 и shTrim32). Анализ уровней LC3-II в присутствии или в отсутствие ингибиторов лизосом показал, что базальный поток аутофагии нарушается, когда экспрессия AMBRA1 подавляется как в миобластах, так и в мышечных трубках (рис. S1A). Мы также наблюдали частичное ингибирование экспрессии тяжелой цепи миозина в соответствии с ролью базовой аутофагии в поддержании дифференцировки миобластов C2 ( 38 ). Напротив, мы не наблюдали значительных изменений потока аутофагии ни в недифференцированных, ни в дифференцированных клетках, в которых экспрессия TRIM32 подавлялась, указывая тем самым, что TRIM32 незаменим для поддержания базальной аутофагии (рис. S1B).

    TRIM32, как сообщается, играет важную роль в восстановлении мышечных волокон после атрофических состояний ( 20 ).Поскольку аутофагия активируется во время мышечной атрофии ( 5 ), мы решили исследовать роль TRIM32 в индукции аутофагии в ответ на атрофические стимулы. Чтобы создать экспериментальные условия для индукции атрофии мышц in vitro, мы обработали дифференцированные клетки C2.7 дексаметазоном, синтетическим аналогом глюкокортикоидов, в течение 24 часов и проверили индукцию атрофии, проанализировав уровень экспрессии атрофического гена MuRF1 ( рис. S2A). Параллельно с этим мы оценили поток аутофагии через 4 часа лечения с помощью иммуноблоттинга LC3, который подтвердил, что аутофагия индуцируется дексаметазоном (рис.S2B).

    Подобно тому, что наблюдается при базальной аутофагии, клетки shAmbra1 C2.7, обработанные дексаметазоном, показали более низкие уровни LC3-II (рис. S2C). Примечательно, что значительное нарушение индукции аутофагии также наблюдалось, когда нокдаун TRIM32 или миотрубки КО подвергались воздействию дексаметазона (рис. 2A и рис. S2, D и E). Нарушение аутофагии при подавлении TRIM32 не ограничивалось клетками C2.7, поскольку аналогичный дефект также наблюдался в миобластах L6E9 крысы при лечении дексаметазоном (рис.S2F). Мы подтвердили неспособность подавленных Trim32 клеток C2.7 увеличивать поток аутофагии путем измерения скорости лизосомной деградации рецептора груза аутофагии NBR1 (рядом с белком гена 1 BRCA1) в более поздний момент времени лечения дексаметазоном (рис. S3A), поскольку а также ультраструктурным анализом. В частности, просвечивающая электронная микроскопия показала, что количество компартментов деградации (амфисомы, лизосомы и аутолизомы) на клеточный срез, которое отражает аутофагическую активность ( 39 ), было сходным у необработанных shControl и shTrim32 C2.7 клеток (рис. S3B), подтверждая, что TRIM32 не участвует в базальной аутофагии. Стимуляция атрофии в контрольных клетках приводила к увеличению числа деградирующих компартментов на клеточную секцию, подтверждая индукцию аутофагии в этих условиях (фиг. 2B и фиг. S3C, вверху). Напротив, не наблюдалось увеличения в TRIM32-истощенных клетках, подвергнутых воздействию дексаметазона, что лежит в основе того, что TRIM32 необходим для аутофагии в атрофических мышечных трубках (Fig. 2B and Fig. S3C, bottom).

    Инжир.2 Trim32 необходим для индукции аутофагии атрофическими стимулами в мышечных клетках. Клетки shCTR

    ( A ) и shTrim32 C2.7, дифференцированные в течение 3 дней, обрабатывали дексаметазоном (dexa) в течение 4 часов (час) или оставляли без обработки. За час до лизиса клетки инкубировали с ингибиторами лизосом E64d и пепстатином A (E64d / PepA), как указано. Уровни LC3-II и TRIM32 анализировали иммуноблоттингом (слева). GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) был включен в качестве контроля загрузки.На графике (справа) представлены средние значения ± стандартное отклонение значений LC3-II / GAPDH из трех независимых экспериментов; * P <0,05. ( B ) Дифференцированные клетки shCTR и shTrim32 C2.7 обрабатывали дексаметазоном в течение 4 часов и обрабатывали для ЭМ. ER, эндоплазматический ретикулум; N, ядро. Желтыми звездочками выделены компартменты деградации (амфисомы, лизосомы и автолизосомы). Масштабные линейки, 1 мкм. На графике (справа) представлены средние значения ± SEM деградационных вакуолей на ячейку на срез. Изображения необработанных клеток представлены на рис.S3B. ( C ) Мышам WT ( Trim32 + / + ) и KO ( Trim32 - / - ) вводили дексаметазон (5 мг / кг) или физиологический раствор (0,9% NaCl) в качестве отрицательного результата. контроль. Мышей умерщвляли через 8 часов после инъекции и получали экстракты белка из четырехглавой мышцы. Уровни LC3-II, NBR1 и p62 анализировали иммуноблоттингом (слева). Стрелки указывают на полосы, специфичные для TRIM32 и NBR1; знак числа (#) указывает на неспецифические сигналы. На графике (справа) представлены средние значения ± стандартное отклонение значений LC3-II / GAPDH, NBR1 / GAPDH и p62 / GAPDH по меньшей мере из трех независимых экспериментов; * P <0.05.

    Чтобы подтвердить участие TRIM32 в регуляции аутофагии в атрофических условиях, мы проанализировали поток аутофагии при недостатке питательных веществ в качестве альтернативного атрофического стимула. Кроме того, в этом случае сниженная индукция аутофагии наблюдалась в TRIM32-молчащих клетках при анализе уровней LC3-II (рис. S4A). Мы подтвердили дефектную аутофагию, измерив скорость лизосомной деградации грузового рецептора p62 аутофагии в молчащих клетках shTrim32 в более позднюю временную точку лишения питательных веществ (рис. S4B).

    Затем мы оценили, требуется ли TRIM32 для эффективного ответа аутофагии на атрофические стимулы in vivo, используя модель Trim32 на мышах ( 22 ). Мы обработали Trim32 мышей дикого типа (WT) и KO дексаметазоном в течение 8 часов и проанализировали уровни LC3, NBR1 и p62 в четырехглавой мышце с помощью иммуноблоттинга. Как показано на фиг. 2C, значительное нарушение аутофагии наблюдается у мышей Trim32 KO после лечения дексаметазоном по сравнению с аналогом WT.Уровни РНК NBR1 и p62 также измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР), чтобы исключить вклад транскрипции в наблюдаемые изменения (рис. S5, A и B). Дефектный ответ аутофагии был подтвержден также конфокальной микроскопией. В четырехглавой мышце мышей WT, получавших дексаметазон, наблюдалось устойчивое увеличение LC3-положительных везикул, которые в основном колокализовались с рецептором груза p62 (рис. S5, C и D). Вместо этого накопление LC3-положительных везикул было снижено у мышей Trim32 KO по сравнению с остаточными, что свидетельствует об уменьшении совместной локализации с p62 (рис. S5, E и F).

    Ингибирование аутофагии, как известно, усугубляет повреждение мышц в ответ на атрофические стимулы, что приводит к накоплению активных форм кислорода (АФК) из дисфункциональных митохондрий и повышенной индукции атрофических генов ( 40 , 41 ). Поэтому мы оценили, связаны ли эти изменения с нарушением аутофагии, наблюдаемым при ингибировании TRIM32. Миотрубки с молчанием TRIM32 и относительный контроль обрабатывали дексаметазоном, а продукцию ROS анализировали через 24 часа (рис.S6A), тогда как экспрессию атрофического гена MuRF1 контролировали через 8 и 24 часа (рис. S6, B и C). Мы также обрабатывали контрольные клетки ингибитором аутофагии 3-метиладенином (3MA) в качестве положительного контроля ингибирования аутофагии (рис. S6D). Одновременно мы проанализировали уровни LC3-II через 24 часа после лечения дексаметазоном, чтобы подтвердить, что нарушение аутофагии все еще присутствовало в моменты времени, когда измерялись уровни ROS и MuRF1 (рис. S6E). Результаты показали, что оба параметра, связанные с атрофией, ухудшились в TRIM32-молчащих клетках, аналогично тем, которые наблюдались в контрольных клетках, подвергшихся воздействию 3MA.Вместе эти результаты указывают на роль TRIM32 в регуляции аутофагии в атрофических условиях.

    TRIM32 стимулирует активность ULK1 AMBRA1-зависимым образом через неякоренный полиубиквитин, связанный с K63.

    Сообщалось, что

    TRIM-белки контролируют аутофагию, модулируя активность BECLIN 1 и ULK1 ( 27 ). Поэтому мы спросили, может ли TRIM32 регулировать аутофагию, взаимодействуя с этими регуляторами аутофагии. Эксперименты по коиммунопреципитации, проведенные на 293 Т-клетках, трансфицированных векторами, кодирующими TRIM32, ULK1 и BECLIN 1, показали, что TRIM32 эффективно взаимодействует с ULK1 (рис.3А). Это взаимодействие специфично для ULK1, поскольку связывание с BECLIN 1 не наблюдалось в тех же экспериментальных условиях (рис. 3A). Мы картировали домен TRIM32, ответственный за взаимодействие с ULK1, путем иммунопреципитации ряда мутантов с делецией TRIM32, которые показали, что TRIM32 связывает ULK1 через свой каталитический домен (рис. 3B). На основании способности AMBRA1 связываться как с ULK1, так и с TRIM32, мы спросили, играет ли AMBRA1 роль во взаимодействии между этими белками. Анализ коиммунопреципитации показал, что ассоциация между TRIM32 и ULK1 сильно нарушается, когда экспрессия AMBRA1 снижается (рис.3C), указывая на то, что AMBRA1 требуется для сборки TRIM32 и ULK1 в комплексе.

    Рис. 3 TRIM32 связывается с ULK1 зависимым от AMBRA1 образом.

    ( A ) Белковые экстракты из 293 Т-клеток, трансфицированных векторами, кодирующими HA-TRIM32, FLAG-BECLIN 1 и MYC-ULK1, как указано, подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против НА. Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против FLAG, против MYC и против HA. ( B ) TRIM32 KO 293 Т-клетки котрансфицировали векторами, кодирующими MYC-ULK1 и следующие конструкции FLAG-TRIM32: полноразмерный, каталитический домен (RING / B-бокс, аминокислоты от 1 до 133), центральная область, содержащая домен спиральной спирали (аминокислоты 134–198) и повторы NHL (аминокислоты 199–325). Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против FLAG. Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против FLAG и против MYC. Показана схема доменной архитектуры TRIM32; красная полоса указывает на домен, взаимодействующий с ULK1. ( C ) Контрольные shRNA и shAmbra1 Т-клетки 293 трансфицировали вектором, кодирующим MYC-ULK1, отдельно или в комбинации с FLAG-TRIM32. Клетки лизировали и белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против FLAG.Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против MYC и против FLAG. Все экстракты также зондировали антителом против AMBRA1 для проверки сайленсинга AMBRA1.

    Поскольку TRIM32 представляет собой убиквитинлигазу E3, мы оценили, приводит ли его взаимодействие с ULK1 к увеличению убиквитинирования ULK1. С этой целью мы проанализировали деградационное и недеградационное убиквитинирование эндогенного ULK1 в Т-клетках 293, трансфицированных TRIM32, с использованием антител к полиубиквитиновой цепи, связанной с K48 и K63, соответственно. Как показано на рис. 4A, TRIM32 запускает K63-связанное убиквитинирование ULK1, тогда как K48-связанное убиквитинирование остается неизменным (рис. S7A). Увеличение убиквитинирования ULK1 зависит от лигазной активности TRIM32, поскольку каталитически неактивный мутант не способен запускать убиквитинирование ULK1 (рис. S7B). Мы также подтвердили способность TRIM32 убиквитинировать ULK1 с помощью анализов in vitro с использованием рекомбинантного или иммуноочищенного ULK1 (фиг. 4B и фиг. S7C). В соответствии с его ролью в образовании комплекса TRIM32-ULK1, подавление AMBRA1 приводит к значительному снижению TRIM32-опосредованного убиквитинирования ULK1 (рис.4С).

    Фиг. 4 TRIM32 стимулирует активность ULK1 AMBRA1-зависимым образом через неякоренный полиубиквитин, связанный с K63.

    ( A ) Белковые экстракты из FLAG-TRIM32-трансфицированных Т-клеток 293 подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против ULK1. Иммуноочищенные комплексы анализировали с помощью иммуноблоттинга для выявления ULK1 и K63-связанного убиквитина. Все экстракты также зондировали антителом против FLAG для подтверждения трансфекции TRIM32. ( B ) Анализ убиквитинирования ULK1 in vitro с использованием иммуноочищенного Flag TRIM32 и рекомбинантного ULK1, HA-убиквитина, Ub-активирующего фермента E1 (UBE1) и E2 Ub-конъюгирующего фермента (UBE2N).Реакции также проводили в отсутствие UBE1 для проверки специфичности реакции убиквитинирования. В конце реакции ULK1 очищали иммуноочисткой и убиквитинирование оценивали иммуноблоттингом с использованием антитела против НА (дорожки 1 и 2). Чтобы проверить, был ли убиквитин ковалентно связан, иммуноочищенный ULK1 кипятили в 1% SDS после реакции убиквитинирования, реиммунопреципитировали (Re-IP) и анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против HA и против ULK1 (дорожки 3 и 4). ( C ) Т-клетки shCtr или shAmbra1 293 трансфицировали вектором, кодирующим FLAG-TRIM32, или пустым вектором (-).Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против ULK1. Иммуноочищенные комплексы анализировали с помощью иммуноблоттинга для выявления ULK1 и K63-связанного убиквитина. Полные экстракты также зондировали антителами FLAG и AMBRA1 для подтверждения трансфекции TRIM32 и молчания AMBRA1 соответственно. ( D ) Т-клетки 293 трансфицировали векторами, кодирующими убиквитин, меченный НА, FLAG-ULK1 и TRIM32, как указано. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против FLAG.Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом для обнаружения K63-связанного убиквитина и ULK1 с использованием специфических антител. Экспрессию TRIM32 также анализировали в общих экстрактах. Чтобы проверить, был ли убиквитин ковалентно связан, иммуноочищенный FLAG-ULK1 кипятили в 1% SDS, реиммунопреципитировали и анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против K63-связанного убиквитина и против ULK1. ( E ) Т-клетки 293 трансфицировали векторами, кодирующими FLAG-VPS34, отдельно или в комбинации с HA-TRIM32. TRIM32, VPS34 и фосфо-VSP34 [pVPS34; Ser , 249 (S249)] анализировали иммуноблоттингом. GAPDH был включен в качестве контроля загрузки. ( F ) Т-клетки 293 трансфицировали векторами, кодирующими FLAG-BECLIN 1, отдельно или в комбинации с HA-TRIM32. Уровни TRIM32, BECLIN 1 и фосфо-BECLIN 1 [pBECLIN 1; Ser 15 (S15)] анализировали иммуноблоттингом. GAPDH был включен в качестве контроля загрузки.

    Поскольку сообщалось, что TRIM32 продуцирует как связанные с субстратом, так и свободные цепи полиубиквитина ( 23 , 42 ), мы проанализировали, является ли TRIM32-индуцированная модификация ULK1 результатом ковалентного убиквитинирования или связывания с незакрепленным полиубиквитином.С этой целью мы подвергли убиквитинированный ULK1, очищенный методом иммуноочистки либо из TRIM32-трансфицированных клеток, либо в анализе in vitro, тепловой денатурации, чтобы нарушить нековалентные взаимодействия. Иммуноблоттинг-анализ показал, что сигнал убиквитинирования теряется после денатурации [рис. 4, B и D (см. Дорожки, обозначенные как Re-IP)], указывая на то, что ULK1 нековалентно связывается с цепями полиубиквитина, связанными с K63, продуцируемыми TRIM32. Более того, мы наблюдали, что взаимодействие с полиубиквитиновыми цепями опосредуется С-концевым доменом ULK1, как показано при котрансфекции TRIM32 с мутантами с делецией ULK1 (рис.S7D).

    Поскольку K63-связанное убиквитинирование ULK1 стимулирует его киназную активность ( 31 ), мы спросили, может ли TRIM32 способствовать проаутофагической функции ULK1. Анализ фосфорилирования аутофагических белков VPS34 и BECLIN 1, двух хорошо охарактеризованных мишеней ULK1 ( 43 , 44 ), показал, что активность киназы ULK1 потенцируется TRIM32 (фиг. 4, E и F). В соответствии с этими результатами, мы также наблюдали, что сверхэкспрессия WT TRIM32, но не каталитического мутанта C39S, приводит к увеличению потока аутофагии, что выявлено иммуноблоттингом LC3 (рис.S7E). Вместе эти данные показывают, что TRIM32 может индуцировать аутофагию, взаимодействуя с ULK1 AMBRA1-зависимым образом и способствуя его активности посредством незакрепленного полиубиквитина.

    TRIM32 необходим для активации ULK1 посредством K63-связанного полиубиквитина в атрофических условиях

    Способность TRIM32 связывать и активировать ULK1 через незащищенный полиубиквитин побудила нас проанализировать функциональную связь между TRIM32 и ULK1 в индукции аутофагии атрофическими стимулами.Во-первых, с помощью анализов коиммунопреципитации, проведенных в необработанных и обработанных дексаметазоном клетках C2.7, мы наблюдали, что индукция атрофии стимулирует взаимодействие ULK1 с TRIM32 (фиг. 5A), а также его ассоциацию с K63-связанным полиубиквитином (фиг. 5B). . Затем мы исследовали, требуется ли TRIM32 для увеличения ассоциации ULK1 с K63-связанным полиубиквитином при стимуляции атрофии. Подавление экспрессии TRIM32 в клетках C2.7 за счет РНК-интерференции заметно снижает количество K63-связанного полиубиквитина, коиммунопреципитированного с ULK1, после обработки дексаметазоном (рис.5С). Соответственно, активность ULK1 снижалась при подавлении TRIM32, как показано анализом статуса фосфорилирования BECLIN 1 и ATG14 (AuTophaGy related 14), двух субстратов ULK1 (фиг. 5, D и E). Вместе эти результаты показывают, что нарушение аутофагии в TRIM32-дефицитных мышечных клетках связано с дефектной активацией ULK1, опосредованной K63-связанным полиубиквитином.

    Рис. 5 TRIM32 необходим для активации ULK1 через K63-связанный полиубиквитин после лечения дексаметазоном.

    ( A ) FLAG-TRIM32-экспрессирующие клетки C2.7, дифференцированные в течение 3 дней, обрабатывали дексаметазоном в течение 1 и 2 часов. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против FLAG. Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом для обнаружения присутствия TRIM32 и ULK1 с использованием специфических антител. ( B ) Клетки C2.7, дифференцированные в течение 3 дней, обрабатывали дексаметазоном в течение 1 и 2 часов. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против ULK1.Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом на присутствие ULK1 и K63-связанного полиубиквитина. Неродственное антитело использовали в качестве отрицательного контроля (IP CTR). ( C ) Клетки shCTR и shTrim32 C2.7, дифференцированные в течение 3 дней, обрабатывали дексаметазоном в течение 2 часов. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против ULK1. Иммуноочищенные комплексы анализировали с помощью иммуноблоттинга для обнаружения присутствия ULK1 и K63-связанного убиквитина. Неродственное антитело использовали в качестве отрицательного контроля.Все экстракты зондировали антителом против TRIM32 для проверки эффективности подавления звука. ( D ) BECLIN 1, сверхэкспрессирующий Trim32. Клетки WT и KO C2.7 дифференцировали в течение 3 дней и инкубировали с дексаметазоном или средой, лишенной питательных веществ (Starv), в течение 2 часов. Белковые экстракты анализировали методом иммуноблоттинга для измерения уровней фосфо-BECLIN 1 [pBCN 1 (Ser 15 )], BECLIN 1 и TRIM32. GAPDH был включен в качестве контроля загрузки. ( E ) Trim32 WT и KO C2.7 клеток, дифференцированных в течение 3 дней, инкубировали с дексаметазоном в течение 2 часов. Клетки лизировали, и экстракты белков анализировали с помощью иммуноблоттинга для измерения уровней фосфо-ATG14 [pATG14 (Ser 29 )], ATG14 и TRIM32. GAPDH был включен в качестве контроля загрузки.

    Мы также подтвердили ключевую роль ULK1 в ответе на атрофические стимулы путем ингибирования экспрессии NEDD4L, убиквитинлигазы E3, которая нацелена на ULK1 для опосредованного протеасомами разрушения ( 45 ).Как показано на рис. S8 (A и B), подавление NEDD4L в миобластах C2.7 привело к стабилизации белка ULK1, что привело к более высокой индукции аутофагии из-за недостатка питательных веществ.

    Патогенные мутанты TRIM32 дефектны по связыванию ULK1 и индукции аутофагии

    Специфические мутации в TRIM32 являются причиной мышечного заболевания LGMD2H ( 12 ). Поскольку нарушение регуляции аутофагии играет важную роль при различных мышечных дистрофиях ( 4 ), мы спросили, имеют ли ассоциированные с заболеванием мутанты TRIM32 нарушенную проаутофагическую активность. Сначала мутанты TRIM32 были протестированы на способность связывать ULK1 в эксперименте по коиммунопреципитации. Как показано на фиг. 6A, на связывание TRIM32 с ULK1 серьезно влияют все протестированные патогенные мутации. Поскольку взаимодействующий с ULK1 домен TRIM32 отличается от повторов NHL (см. Рис. 3B), где расположены связанные с заболеванием мутации, мы решили лучше выяснить роль этого домена в связывании с ULK1, создав мутант TRIM32. не хватает повторов всей НХЛ. При тестировании в анализе коиммунопреципитации мутант ΔNHL TRIM32 также не смог взаимодействовать с ULK1 (рис.S8C), указывая на то, что повторы NHL, хотя и недостаточные для связывания, должны присутствовать, чтобы позволить взаимодействие TRIM32 с ULK1 в контексте всего белка.

    Рис. 6 Патологические мутанты TRIM32 неспособны взаимодействовать с ULK1 и способствовать аутофагии.

    ( A ) 293 Т-клетки трансфицировали вектором, кодирующим MYC-ULK1, отдельно или в комбинации с HA-TRIM32 WT, или указанными патогенными мутантами TRIM32. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антитела против НА.Иммуноочищенные комплексы анализировали иммуноблоттингом для обнаружения присутствия TRIM32 и ULK1. ( B ) TRIM32 Клетки KO C2.7 были инфицированы ретровирусами, кодирующими WT FLAG-TRIM32 или указанные патогенные мутанты TRIM32. EMPTY, TRIM32 KO C2.7 клеток, инфицированных некодирующими ретровирусами. Через 3 дня в среде для дифференцировки клетки обрабатывали дексаметазоном в течение 4 часов и инкубировали с ингибиторами лизосом E64d и пепстатином A в течение 1 часа перед лизисом, как указано.Уровни LC3-II и TRIM32 анализировали иммуноблоттингом с использованием специфических антител. GAPDH был включен в качестве контроля загрузки. ( C ) Фибробласты от донора WT и пациента с LGMD2H были трансдифференцированы в миобласты посредством эктопической экспрессии MYOD (миогенная дифференцировка 1). Клетки, дифференцированные в течение 3 дней, обрабатывали или не обрабатывали дексаметазоном в течение 2 и 4 часов. За час до лизиса клетки инкубировали с ингибиторами лизосом E64d и пепстатином A, как указано. Уровни LC3-II и тяжелой цепи миозина (MYOSIN HC) анализировали с помощью иммуноблоттинга (нижняя панель).GAPDH был включен в качестве контроля загрузки.

    Мы также проверили, влияют ли патогенные мутации на взаимодействие между TRIM32 и AMBRA1. Мы заметили, что AMBRA1 все еще может взаимодействовать со всеми протестированными мутантами, что позволяет предположить, что патогенные мутации специфически нарушают взаимодействие с ULK1 (рис. S8D).

    Чтобы проверить, влияет ли дефектное связывание патогенных мутантов Trim32 с ULK1 на их способность стимулировать проаутофагическую активность ULK1, мы дополнительно охарактеризовали два из них: Trim32 D487N и Trim32 R394H .Во-первых, мы проанализировали уровни ULK1-ассоциированного полиубиквитина и ULK1-опосредованного фосфорилирования BECLIN 1 при сверхэкспрессии TRIM32 WT или мутантного белка в 293 Т-клетках. Мы обнаружили, что оба патогенных мутанта TRIM32 показали пониженную способность способствовать ассоциации ULK1 с K63-связанным полиубиквитином (фиг. S8E) и фосфорилированию BECLIN 1 на Ser 15 (фиг. S8F), подтверждая их дефектную способность индуцировать активность ULK1.

    Затем мы проанализировали, обладают ли патогенные мутанты TRIM32 нарушенной способностью вызывать аутофагию в ответ на индукцию атрофии в клетках миобастов.С этой целью мы дополнили клетки Trim32 KO C2.7 ретровирусными векторами, экспрессирующими TRIM32 WT, патогенными мутантами Trim32 D487N и Trim32 R394H или каталитическим мутантом Trim32 C39S . Мы обрабатывали клетки дексаметазоном и анализировали поток аутофагии путем измерения уровней LC3-II (фиг. 6B и фиг. S9, A и B) и NBR1 (фиг. S9C) в присутствии или в отсутствие ингибиторов лизосом. Иммуноблот-анализ показал, что у мутантов TRIM32 нарушена аутофагическая индукция.Кроме того, в этом случае неспособность мутантов TRIM32 запускать аутофагию была связана с дефектной активностью ULK1, как показал анализ фосфорилирования BECLIN 1 и ATG14 на Ser 15 и Ser 29 , соответственно (рис. S10, А и Б).

    Наконец, мы оценили, демонстрируют ли клетки, полученные от пациента с LGMD2H, дефектный ответ аутофагии на атрофию, вызванную дексаметазоном. С этой целью фибробласты от здорового донора (HD) и пациента с LGMD2H, несущие полную делецию гена в одном аллеле и бессмысленном c.1837 мутации C> T (R613X) в домене NHL другого аллеля ( 46 ) были трансдифференцированы в миобластах посредством эктопической экспрессии MYOD (рис. S10C). Мы обрабатывали клетки дексаметазоном и анализировали уровни LC3-II в присутствии или в отсутствие ингибиторов лизосом для измерения аутофагического потока. Примечательно, что индукция аутофагии обработкой дексаметазоном была нарушена в клетках мышечной трубки, несущих мутацию TRIM32 (фиг. 6C и фиг. S10D). Более того, в соответствии с тем, что наблюдается в Trim32-молчащих клетках, индукция атрофии усиливалась в клетках пациентов LGMD2H, о чем свидетельствует анализ уровней MuRF1 (рис.S10E). Вместе эти результаты показывают, что связанные с заболеванием мутации влияют на проаутофагическую функцию TRIM32 (рис. S10F).

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Аутофагия имеет решающее значение для адаптации мышц к сублетальному клеточному стрессу ( 47 ). Физические упражнения повышают уровень аутофагии для удовлетворения энергетических потребностей и устранения дисфункциональных компонентов клетки, таких как митохондрии и белки саркомера, которые могут накапливаться во время сокращения ( 48 , 49 ). Аутофагия также индуцируется во время длительного бездействия или других атрофических стимулов, в основном для обеспечения удаления избытка органелл, таких как митохондрии и саркоплазматический ретикулум, во время ремоделирования мышечных волокон ( 50 ).Хотя аутофагия способствует разборке мышц, она считается защитным механизмом, предотвращающим накопление вредных сигналов, таких как ROS, генерируемых неработающими отделами ( 4 ).

    То, как аутофагия регулируется в мышечных клетках, широко исследовалось на уровне транскрипции, подчеркивая важную роль FoxO, рецепторов глюкокортикоидов, ядерного фактора κB (NF-κB) и факторов транскрипции SMAD ( 51 ). Напротив, механизмы, с помощью которых стрессы, связанные с неактивностью мышц, передаются на механизм аутофагии для активации процесса, остаются менее изученными.

    Здесь мы сообщаем, что убиквитинлигаза E3 TRIM32 необходима для индукции аутофагии в мышечных клетках атрофическими стимулами с использованием моделей как in vitro, так и in vivo. Проаутофагическая активность TRIM32 заключается в его способности связываться с AMBRA1 и ULK1 и синтезировать связанные с K63 цепи полиубиквитина, которые нековалентно связываются с ULK1, чтобы способствовать его активности (рис. S10F).

    Известно, что незакрепленные цепи полиубиквитина играют ключевую роль в регуляции киназной активности ( 52 ).Большинство доказательств получено из исследований путей врожденного иммунитета, показывающих, что трансформирующий фактор роста β-активированная киназа 1 (TAK 1), ингибитор ядерного фактора κB киназы ε (IKKε) и эссенциальный модулятор NF-каппа-B (NEMO) могут быть активированы нековалентным взаимодействием с цепями полиубиквитина, что приводит к изменению структурной конформации и / или партнеров по взаимодействию этих киназ ( 53 - 55 ). В этом контексте лигазы TRIM E3 становятся ключевыми игроками ( 56 ), как показано для TRIM5, TRIM6, TRIM25 и TRIM32, причем последний применяет эту стратегию для активации NEMO в ответ на цитозольную двухцепочечную ДНК ( 42 ).Здесь мы показываем, что незакрепленные цепи полиубиквитина также участвуют в регуляции аутофагического процесса. TRIM32 синтезировал K63-связанные цепи убиквитина, связанные с ULK1 через его C-концевой домен, что приводило к усиленному фосфорилированию его субстратов BECLIN 1 и VPS34. В отличие от того, что сообщалось для других TRIM, мы не наблюдали повышенного взаимодействия между комплексами ULK1 и BECLIN 1 при активации TRIM32, предполагая, что связывание с цепями полиубиквитина стимулирует активность ULK1, а не способствует взаимодействиям белковых комплексов.

    Наши данные также подчеркнули центральную роль AMBRA1 в передаче множественных сигналов убиквитина аппарату аутофагии для его активации в специфических клеточных контекстах. В атрофических мышечных клетках AMBRA1 действует как важный кофактор, необходимый как для взаимодействия, так и для убиквитинирования ULK1 с помощью TRIM32. Ранее было показано, что AMBRA1 регулирует активность ULK1, опосредуя его ковалентное убиквитинирование с помощью фактора 6, связанного с рецептором TNF-лигазы E3 (TRAF6) ( 31 ).Хотя функция TRAF6 и TRIM32 может казаться избыточной в регуляции аутофагии, эти белки играют противоположные роли в активации программы атрофии ( 20 , 57 , 58 ). Инактивация TRAF6 значительно нарушает индукцию экспрессии MuRF в атрофических условиях из-за его роли в активации пути NF-κB ( 57 ). Напротив, подавление TRIM32 приводит к более высокой индукции MuRF1 в миобластах, обработанных дексаметазоном, что согласуется с тем, что наблюдается при удалении генов аутофагии ( 40 ).

    Важную роль TRIM32 в мышечной атрофии приписывают его способности ингибировать преждевременное старение сателлитных клеток, ответственных за возобновление роста мышц in vivo ( 20 ). Наши результаты, показывающие дефектную мышечную аутофагию в атрофических условиях, предполагают, что, помимо регуляции стволовых клеток, TRIM32 может также вносить вклад в сохранение функции дифференцированных мышечных клеток за счет снижения накопления ROS и экспрессии MuRF1.

    Доказательства того, что изменение TRIM32-зависимой аутофагии может иметь важное значение для LGDM2H, подчеркивается двумя наборами данных.Во-первых, мы обнаружили дефектную аутофагию в миобластах, полученных из фибробластов пациента с LGDM2H. Во-вторых, мы обнаружили, что ассоциированные с болезнью мутанты TRIM32 не могут взаимодействовать с ULK1 (их связывание с AMBRA1, однако, не изменяется) и индуцировать аутофагию в мышечных клетках после лечения дексаметазоном, что сопровождается накоплением аутофагических грузовых рецепторов NBR1. и p62, более высокая индукция MuRF1 и повышенная продукция ROS (рис. S10F). Необходимы дальнейшие исследования для выяснения молекулярной основы этого изменения, поскольку повторы NHL, в которых расположены патологические мутации, не опосредуют взаимодействие TRIM32 с ULK1, которое происходит через область RING / B-бокса.Мы обнаружили, что мутант TRIM32, лишенный повторов NHL, также неспособен связывать ULK1, предполагая, что этот домен необходим для того, чтобы сделать домен RING / B-бокса доступным для мишеней в присутствии области спиральной спирали.

    В заключение мы определили TRIM32 как убиквитинлигазу E3, которая регулирует активность ULK1 в мышцах в условиях атрофии, подчеркивая новый путь аутофагии, потенциально имеющий значение при заболеваниях человека. В свете этих результатов можно предсказать, что проаутофагическая активность TRIM32 может иметь отношение к другим процессам, регулируемым TRIM32, таким как развитие нейронов, онкогенез и иммунный ответ ( 16 ), в которых его партнер AMBRA1 также играет важную роль. роли ( 30 , 59 , 60 ).

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Культура клеток

    293 Т-клетки (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Sigma-Aldrich, D6546), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, 10270) , 2 мМ l-глутамина и 1% раствор пенициллина / стрептомицина (Sigma-Aldrich, G7513; P0781) при 37 ° C и 5% CO 2 . Клетки миобластов C2.7 мыши ( 61 ), клетки миобластов L6E9 крыс ( 62 ) и клетки миобластов человека, полученные из фибробластов, от HD и пациента с LGMD2H культивировали в DMEM с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки. 2 мМ l-глутамин и 1% раствор пенициллина / стрептомицина при 37 ° C и 5% CO 2 .Дифференцировку миобластов индуцировали путем культивирования клеток в среде DMEM с добавлением 2% лошадиной сыворотки (Life Technologies, 16050122), 2 мМ l-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина в течение указанного периода времени. Фибробласты от HD и пациента с LGMD2H были предоставлены в рамках проекта Telethon Network of Genetic Biobankks No. GTB12001. Для подготовки фибробластов биопсия кожи пациента была взята после информированного согласия и одобрения этического комитета Университета Феррары. В базе данных часто ошибочно идентифицируемых клеточных линий, поддерживаемой Международным комитетом по аутентификации клеточных линий и Национальным центром биотехнологической информации, не было обнаружено клеточных линий, используемых в этом исследовании.Скрининг клеток на загрязнение микоплазмой проводили с помощью ПЦР (ABMgood, G238).

    Для оценки аутофагии клетки C2.7 и миобласты, дифференцированные HD / LGMD2H, обрабатывали 400 мкМ дексаметазона (Calbiochem, 265005) в присутствии или в отсутствие E64d / пепстатина A (5 мкг / мл) (Santa Cruz Biotechnology, sc -201280A и sc-45036) или 5 нМ бафиломицина A1 (Sigma-Aldrich, B1793) или инкубировали со средой, лишенной питательных веществ, сбалансированным солевым раствором Эрла (Sigma-Aldrich, E2888) в течение указанного времени в соответствии с руководящими принципами. Ингибитор аутофагии 3MA (Sigma-Aldrich, M9281) использовали в концентрации 5 мМ.

    Трансдифференцировка миобластов

    Препарат миобластов был получен путем трансдукции человеческих фибробластов от здоровых пациентов или пациентов с мутантом Trim32 лентивирусом цитомегаловируса (CMV) MyoD-ER (T) (Addgene) с множественностью инфекции 20 и обработанных 1 мкМ 4OH- тамоксифен (Sigma-Aldrich, H7904) для активации MyoD-ER (T). Трансдифференцировку подтверждали ПЦР-анализом MyoD и экспрессии миогенина.Анализ аутофагии проводили в отсутствие 4ОН-тамоксифена.

    Исследования на животных

    Trim32 KO мышей были описаны ранее ( 22 ). Мышей TRIM32 KO и WT содержали и лечили в соответствии с утвержденными протоколами и в соответствии с институциональными и национальными инструкциями и правилами (IP00001489), утвержденными Орегонским университетом здравоохранения и науки. Для анализа реакции аутофагии на дексаметазон трехмесячным мышам ( n = 4 для каждого генотипа) подкожно вводили натриевую соль дексаметазона (5 мг / кг; Sigma-Aldrich, D-1756) и готовили в физиологическом растворе. решение (транспортное средство, 0.9% NaCl). Контрольная группа получила инъекцию физиологического раствора (носитель, 0,9% NaCl). Через восемь часов после инъекции мышей умерщвляли, собирали четырехглавые мышцы и глубоко замораживали в жидком азоте перед хранением при -80 ° C для последующей экстракции белка. Для анализа иммуноблоттинга замороженные мышцы измельчали ​​в мелкий порошок с помощью молотка, ресуспендировали в буфере для экстракции (Coimmunoprecipitation Kit, Thermo Fisher Scientific, 14321D), с добавлением ингибиторов протеазы, фосфатазы и деубиквитиназы, как описано выше, гомогенизировали с использованием гомогенизатора Dounce. , инкубировали при 4 ° C в течение 30 минут и центрифугировали при 13000 об / мин в течение 10 минут для удаления мусора.Такое же количество общего белка (30 мкг на лунку) загружали на электрофорез в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) для анализа иммуноблоттинга.

    Трансфекция и вирусная инфекция

    293 Т-клетки временно трансфицировали векторами экспрессии с использованием кальций-фосфатного метода, как описано ранее ( 32 ). Для получения ретровирусов упаковывающие клетки [293 gp / bsr (ген устойчивости к gag-pol / бластицидину)] котрансфицировали 15 мкг ретровирусных векторов и 5 мкг pCMV-VSV-G с использованием метода фосфата кальция.Для получения лентивирусов 293 Т-клетки котрансфицировали 10 мкг лентивирусных векторов, 2,5 мкг плазмиды pCMV-VSV-G и 7,5 мкг плазмиды psPAX2 с использованием кальций-фосфатного метода. Через 48 часов супернатант, содержащий ретровирусные или лентивирусные частицы, собирали, ультрацентрифугировали при 19800 об / мин на роторе SW28 в течение 2 часов и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) (500 мкл на 20 мл супернатанта). Клетки инфицировали 80 мкл вирусной суспензии в среде с добавлением полибрена (4 мкг / мл) в течение 8 часов.Для повышения эффективности было выполнено два последовательных цикла заражения.

    Чтобы установить клетки Trim32 KO для анализов мутантной комплементации, клетки C2.7 временно трансфицировали векторами CRISPR-Cas9 с помощью липофектамина LTX и Plus Reagent (Invitrogen, 15338-100), как указано поставщиком. Трансдуцированные клетки инкубировали с дигидрохлоридом пуромицина (2,5 мкг / мкл; Santa Cruz Biotechnology, sc-108071) только в течение 48 часов для отбора трансфицированных клеток, в которых произошла инактивация Trim32 CRISPR-Cas9, а затем культивировали в отсутствие пуромицина, чтобы избежать отбор клеток со стабильно интегрированным вектором CRISPR-Cas9.

    Плазмиды

    pCDNA3 гемагглютинин (HA) –Trim32 был ранее описан ( 10 ). Мутанты HA-Trim32, соответствующие патогенным мутациям Trim32 в комплементарной ДНК человека (кДНК), были сконструированы с помощью набора для сайт-ориентированного мутагенеза QuickChange (StrateGene).

    Все ретровирусные конструкции были основаны на модифицированной версии вектора pLPCX (Clontech) ( 32 ). Плазмиды pLPCX, кодирующие FLAG- и MYC-WT AMBRA1, мутанты MYC-AMBRA1 (аминокислоты 1-532, 533-751 и 761-1269) и FLAG-BECLIN 1 были описаны ранее ( 30 - 32 ).pLPCX FLAG-TRIM32 и pLPCX TRIM32 были получены субклонированием из pCDNA3 HA-TRIM32. pLPCX FLAG-TRIM32 делеционный мутант RING / B-бокс (аминокислоты от 1 до 136), домен спиральной спирали (аминокислоты от 136 до 326), повторы NHL (аминокислоты от 327 до 653) и ΔNHL (аминокислоты от 1 до 325) были созданы с использованием соответствующих олигонуклеотидов и амплификации с последующей вставкой в ​​рамку считывания в вектор pLPCX FLAG. pCDNA3 HA-Trim32 C39S был получен сайт-специфическим мутагенезом; pLPCX FLAG-TRIM32 C39S получали субклонированием из pCDNA3 HA-TRIM32 C39S.pLPCX FLAG-ULK1 и pLPCX MYC-ULK1 получали субклонированием из pcDNA3 Myc-tag ULK1 ( 31 ). Мутанты с делецией pLPCX FLAG-ULK1 (аминокислоты от 1 до 828 и от 829 до 1050) были созданы с использованием соответствующих олигонуклеотидов и амплификации с последующей вставкой в ​​рамку считывания в вектор pLPCX FLAG. pRK5 HA-UBIQUITIN был получен от Addgene (# 17608). Универсальный лентивирусный вектор CRISPR-Cas9, специфичный для человеческого TRIM32 и мышиного TRIM32 [hTRIM32 single-guide RNA (sgRNA), K2465605; mTRIM32 sgRNA, K3452705] и контрольную sgRNA (scramble sgRNA, K010) были приобретены у ABMgood.

    Для стабильной интерференции мРНК Trim32 мышей использовали две лентивирусные плазмиды Trim32 , нацеленные на мРНК pLKO.1 (TRCN0000040831 и TRCN0000040832; Sigma-Aldrich). Для интерференции стабильной мРНК Ambra1 мыши использовали две плазмиды pLKO.1, нацеленные на мРНК лентивируса Ambra1 (TRCN0000189905 и TRCN0000189940; Sigma-Aldrich). Для стабильной интерференции мРНК AMBRA1 человека использовали плазмиду pLKO.1, направленную на мРНК лентивируса AMBRA1 (TRCN0000168652; Sigma-Aldrich).Для стабильной интерференции мРНК Nedd4L мышей использовали лентивирусную плазмиду pLKO.1, нацеленную на мРНК Nedd4L (TRCN0000086870; Sigma-Aldrich). В качестве отрицательного контроля использовали pLKO.1, содержащий кшРНК немлекопитающих (Sigma-Aldrich).

    Антитела

    Основными антителами, использованными в этом исследовании, были кроличьи антитела против НА (Sigma-Aldrich, H6908), кроличьи антитела против FLAG (Sigma-Aldrich, F7425), мышиные антитела против MYC [Santa Cruz Biotechnology, sc -40 (9E10)], кроличьи антитела против MYC (Millipore, 06-549), кроличьи антитела против BECLIN 1 [Santa Cruz Biotechnology, sc-11427 (H-300)], козьи антитела против BECLIN 1 [Santa Cruz Biotechnology, sc-10086 (D-18)], фосфо-BECLIN 1 кролика (Ser 15 ) [Cell Signaling Technology, 138255 и 84966 (D4B7R)], кроличьи анти-ATG14 [Cell Signaling Technology, 96752 (D1A1N)], кролик фосфо-ATG14 [Cell Signaling Technology, 13155 (S29)], кроличьи антитела против NBR1 (Novus Biologicals, NBP1-71703), LC3 (Cell Signaling Technology, 27755), мышиные антитела против AMBRA1 человека [Santa Cruz Biotechnology, sc-398204 ( G6)], кроличьи антитела против AMBRA1 человека (Novus Biologicals, 261

    ), кроличьи антитела против Ambra1 мыши (Millipore, ABC131), мышиные антитела против мультиубиквитина (MBL International, ST1200), кроличьи антитела против K63-связанного убиквитина (Millipore, 05-1308), кроличий анти-K48-связанный убиквитин (Millipore, 05-1307), кроличий анти-ULK1 [Santa Cruz Biotechnology, sc-33183 (h340)], кроличий анти-ULK1 [Cell Signaling Technology, 80545 (D8H5)], кроличьи анти-TRIM32 (Thermo Fisher Scientific, PA5-22316), кроличьи анти-фосфо-VPS34 (Ser 249 ) (Cell Signaling Technology, 138575), кроличьи анти-VPS34 (Life Technologies, 382100), мышиные антитела против GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) (Millipore, CB1001) и мышиные моноклональные антитела к тяжелой цепи миозина MF20 (Novus Biologicals, MAB4470).

    Анализы иммунопреципитации и иммуноблоттинга

    Коиммунопреципитацию проводили путем лизирования клеток в трис-буфере [10 мМ трис (pH 8,0) (Santa Cruz Biotechnology, sc-3715A), 150 мМ NaCl (Sigma-Aldrich, S7653), 10% глицерин ( Sigma-Aldrich, G7757), 0,5% NP-40 (Sigma-Aldrich, 56741)] или в буфере CHAPS, в случае ULK1, как описано ранее ( 31 ). Буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) [150 мМ NaCl (Sigma-Aldrich, S7653), 1% NP-40 (Sigma-Aldrich, 56741), 0.5% дезоксихолевая кислота (MP Biomedicals, 101496), 0,1% SDS (Sigma-Aldrich, L3771), 50 мМ трис (pH 8,0) (Santa Cruz Biotechnology, sc-3715A) и 2 мМ MgCl 2 (Sigma-Aldrich , M8266)] использовали для анализа уровней убиквитинирования иммунопреципитированных белков и для иммуноблоттинга. Буфер для лизиса был дополнен ингибиторами протеаз и фосфатаз [Protease Inhibitor Cocktail plus (Sigma-Aldrich, P8340), 5 мМ фторида натрия (Sigma-Aldrich, S-7920), 0,5 мМ ортованадата натрия (Sigma-Aldrich, S6508), 1 мМ молибдат натрия (Sigma-Aldrich, S-6646), 50 мМ 2-хлорацетамид (Sigma-Aldrich, C0267), 2 мМ моногидрат 1,10-фенантролина (Sigma-Aldrich, 320056) и 0. 5 мМ фенилметилсульфонилфторид (Sigma-Aldrich, P7626)]. Коиммунопреципитация выполнялась с использованием 1 мг белковых экстрактов из трансфицированных клеток или 3 мг в случае анализа эндогенных белков. Для иммунопреципитации эндогенного белка белковые экстракты инкубировали в течение ночи с 2 мкг антитела, и иммунокомплексы выделяли с использованием 25 мкл протеина A-сефарозы (GE Healthcare, GE 17-1279-01). Для иммунопреципитации сверхэкспрессированных меченых белков экстракты белков инкубировали с 25 мкл антител против FLAG, против HA или против MYC, конъюгированных с агарозными гранулами (Sigma-Aldrich: A22220, A2095 и A7470, соответственно) в течение 2 часов.Чтобы проверить ковалентное связывание цепей полиубиквитина с ULK1, в первом раунде анализа иммунопреципитации получали клеточные экстракты, как описано выше, а затем лизаты инкубировали с антителом против FLAG, конъюгированным с гранулами агарозы, в течение 2 часов. Иммунопреципитаты трижды промывали буфером RIPA. Перед вторым раундом анализа иммунопреципитации иммунопреципитаты денатурировали кипячением в течение 5 минут при 95 ° C в буфере для лизиса, содержащем 1% SDS. Затем элюаты разбавляли 1:10 буфером для лизиса и реиммунопреципитировали антителом против FLAG, конъюгированным с гранулами агарозы, в течение 2 часов.

    Иммунокомплексы разделяли на бис-трис-гелях NuPAGE (Life Technologies, от 4 до 12% EA0378BOX и от 3 до 8% NW04120BOX) и наносили электроблоттингом на нитроцеллюлозные (Whatman Amersham, 10600041) или поливинилидендифторидные мембраны (Millipore, IPVh30200). Обнаружение было достигнуто с использованием вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена [против козьих 705-036-147, против кроличьих 711-036-152 и против мышиных 715-036-150 (Jackson ImmunoResearch Laboratories)] и усиленной хемилюминесценции (ECL) [Immobilon Classico WBLUC0500 и Immobilon Crescendo Western HRP субстрат WBLUR0500 (Millipore)].Сигналы получали с использованием Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare, 28-9068-37) или системы визуализации ChemiDoc.

    Анализ убиквитинирования

    293 Т-клетки независимо трансфицировали плазмидами, кодирующими MYC-ULK1 или FLAG-TRIM32. Спустя 48 часов клетки лизировали в буфере RIPA для очистки ULK1 и в трис-буфере для иммунопреципитации TRIM32, оба из которых содержали ингибиторы протеаз, как указано ранее. Лизаты очищали центрифугированием и подвергали иммунопреципитации в течение 2 часов с использованием связанных с агарозой антител против меток MYC или FLAG.Белок TRIM32 элюировали в течение 1 часа с помощью пептида FLAG (Sigma-Aldrich, F3290) в концентрации 400 нг / мкл в 1X буфере для реакции конъюгирования убиквитина (Boston Biochem, B-70). Анализы убиквитинирования проводили в 100 мкл реакционного объема, комбинируя 20 мкл иммуноочищенного MYC-ULK1, связанного с агарозным антителом Myc, 20 мкл элюированного TRIM32 и следующих рекомбинантных компонентов: 100 нМ Ub-активирующего фермента E1 (Ube1; Boston Biochem, E-305), 1 мкМ E2 Ub-конъюгирующего фермента (Ube2N; Boston Biochem, E2-664) и 50 мкМ HA-убиквитина (Boston Biochem, U-110), ресуспендированных в буфере восстановления убиквитина (Boston Biochem, B -90). В некоторых экспериментах по убиквитинизации in vitro вместо иммуноочищенного белка использовали рекомбинантный белок ULK1 (SignalChem, U01-11G). Реакцию проводили в 1X буфере для реакции конъюгации убиквитина с добавлением Mg2 + –аденозинтрифосфата (Boston Biochem, B-20) в концентрации 2 мМ и инкубировали при 30 ° C в течение 2 часов на качающейся платформе. Если указано, добавляли стадию денатурации, как описано ранее, с последующей реиммунопреципитацией ULK1 с использованием кроличьего антитела против ULK1 h340 (Santa Cruz Biotechnology, sc-33183).Включение убиквитина анализировали иммуноблоттингом с использованием кроличьих анти-НА-антител (Sigma-Aldrich, H6908) для обнаружения НА-убиквитина.

    ПЦР в реальном времени

    ПЦР в реальном времени выполняли, как описано ранее ( 63 ). Вкратце, РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, 15596-018). Синтез кДНК производился с использованием набора для обратной транскрипции (Promega, A3500) в соответствии с рекомендациями производителя. Реакции количественной ПЦР выполняли с использованием Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Ltd.) термоциклер. Master Mix Maxima SYBR Green / ROX qPCR (Thermo Fisher Scientific, K0253) использовали для получения флуоресцентно меченных продуктов ПЦР во время повторяющихся циклов реакции амплификации, а протокол кривой плавления использовали для проверки специфичности зонда, как описано ранее ( 30 ). Следующие наборы праймеров для всех ампликонов были созданы с использованием программной системы Primer-Express 1.0 (Roche): MuRF1 мыши прямой (5'-CCAAGGAAAGAGCAGTATGG-3 ') и обратный (5'-GCAGCTCTCTGGGTTATTG-3'), p62 мыши вперед (5 ′ -TGAAACATGGACACTTTGGCTGGC-3 ′) и обратный (5′-ACATTGGGATCTTCTGGTGGAGCA-3 ′), мышиный NBR1 вперед (5′-GAGATGAGAGGGAGGAGATT-3 ′) и обратный (5′-CTTCAGAG′3-DHAAGAC мышиный TTCAACGGCACAGTCAAG-3 ') и обратный (5'-CCAGTAGACTCCACGACATA-3'), прямой MYOD (5'-CACAACGGACGACTTCTATG-3 ') и обратный MYOD (5'-GTGCTCTTCGGGTTTAAGGTGTGTGTTTAAGGTGTG человека) -3 ') и обратный MYOG (5'-GCCTCATTCACCTTCTTGAG-3') и человеческий GAPDH прямой (5'-CGCTTCGCTCTCTGCTCCT-3 ') и обратный (5'-CCGTTGACTCCGACCTTCAC-3').

    Проточная цитометрия

    Окрашивание митохондрий выполняли путем инкубации дифференцированных клеток C2.7 с 5 мкМ реагентом CellROX Deep Red (Thermo Fisher Scientific, C10422), следуя протоколам производителя, и непосредственно анализировали без фиксации. Анализ клеток выполняли с помощью FACScan (Becton-Dickinson).

    Анализ мышечной ткани с помощью флуоресцентной микроскопии

    Для анализа реакции аутофагии на дексаметазон 6-месячным мышам ( n = 4 для каждого генотипа) подкожно вводили натриевую соль дексаметазона (5 мг / кг; Sigma-Aldrich , D-1756) и приготовленный в физиологическом растворе (носитель, 0.9% NaCl). Контрольная группа получила инъекцию физиологического раствора (носитель, 0,9% NaCl). Через 24 часа после инъекции мышей умерщвляли и четырехглавую мышцу фиксировали 4% формальдегидом в течение 24 часов при комнатной температуре, а после обезвоживания серией разбавлений спиртом и ксилолом ткань заключали в парафин и разрезали на части размером 7 мкм. разделы. Затем срезы депарафинизировали и кипятили в течение 8 мин в предварительно нагретом 10 мМ буфере для извлечения лимонной кислоты (pH 6,0). Затем срезы блокировали PBS, содержащим 1% козьей сыворотки и 0.4% Triton X-100 за 1 час перед инкубацией первичных антител в PBS, содержащем 0,1% Tween 20, в течение ночи при 4 ° C. Ядра окрашивали Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) во время инкубации с вторичным антителом в PBS, содержащем 0,1% твин, при комнатной температуре в течение 1 часа. Флуоресцентную микроскопию выполняли при комнатной температуре с использованием флуоресцентного микроскопа DeltaVision RT (Applied Precision, Issaquah, WA), оборудованного камерой CoolSNAP HQ (Photometrix, Кью, Австралия). Изображения были созданы путем сбора стопок изображений с фокальными плоскостями 0.30 мкм друг от друга, а затем деконволюцию с помощью программного обеспечения SoftWoRx (Applied Precision). Были использованы следующие антитела: кроличьи анти-LC3 (PM036; MBL International, Woburn, MA), анти-p62 морских свинок (GP62-C; Progen, Дарра, Австралия), конъюгированный с Alexa Fluor 568 козий анти-иммуноглобин морской свинки G (IgG; Thermo Fisher Scientific, A-11075), коъюгированные с Alexa Fluor 488 козьи антикроличьи IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific, A27034).

    Электронная микроскопия

    Дифференцированные клетки C2.7, несущие контрольную или нацеленную на TRIM32 shРНК, инкубировали с 400 мкМ дексаметазона в течение 4 часов.Клетки фиксировали до и после обработки дексаметазоном прямым добавлением 5% глутаральдегида (Merck Millipore, 10423

    ) и 4% параформальдегида (Sigma-Aldrich, 441244) в 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,4; Sigma-Aldrich, 20840-100G-F. ) в питательную среду. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре фиксирующий раствор заменяли 2,5% глутаровым альдегидом и 2% параформальдегидом в 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,4), и фиксацию продолжали в течение ночи. Затем клетки залили смолой EPON [на 25 мл, 12 г простого глицидного эфира (SERVA, 21045.02), 8 г ангидрида 2-додецени янтарной кислоты (SERVA, 20755.02), 5 г метилнадиевого ангидрида (SERVA, 29452.02) и 560 мкл N -бензилдиметиламина (Electron Miscroscopy Sciences, 11400-25)]. Затем срезы размером 55 нм были вырезаны и окрашены уранилацетатом и цитратом свинца. Срезы клеток исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа CM100 (80 кВ) (Phillips). Статистически оценивали три разные сетки с сечениями, полученными для одних и тех же препаратов. Для каждой сетки определяли среднее количество деградирующих компартментов (амфисом, автолизосом и лизосом) на клеточный срез путем подсчета 25 случайно выбранных профилей клеток.

    Статистический анализ

    Статистический анализ данных электронной микроскопии был проанализирован с использованием теста Манна-Уитни (независимые образцы и двусторонний; GraphPad). Статистический анализ данных иммуноблоттинга, ПЦР и сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) проводили с использованием непарного двустороннего теста Стьюдента t (программа Excel). Значения показаны как средние ± стандартное отклонение не менее трех независимых экспериментов. P значения <0,05 отмечены звездочкой.Денситометрический анализ иммуноблотов проводили с помощью программы Adobe Photoshop. Коэффициент контроля был произвольно определен как 1,00. Нормальное распределение было принято на основе внешнего вида данных, поскольку n <5. Статистический метод не использовался для предварительного определения размера выборки для исследований на животных. Эксперименты на животных не были рандомизированы. Исследователи не были закрыты для распределения во время экспериментов и оценки результатов. Критерии исключения не применялись для исключения образцов или животных из анализа.

    Выражение признательности: Мы благодарим L. Gonzalez-Cano и JC Schwamborn (Университет Люксембурга) за предоставленные образцы мышц для предварительных экспериментов и R. Maione и A. Musarò (University of Rome Sapienza) за предоставление клеток C2.7 и L6E9. , соответственно. Мы благодарим Genomic Disorder Biobank и Telethon Network of Genetic Biobanks (Telethon Italy grant GTB12001G) за хранение биопрепаратов. Финансирование: Эта работа была частично поддержана грантами Фонда Telethon (GEP12072 для G. MF), AIRC (IG2015 № 17404 для GMF, IG2014 № 14078 для GM и IG2014 № 15244 для MP), Итальянское министерство университетов и исследований (FIRB Accordi di Programma 2011, PRIN 2015 20152CB22L), Итальянское министерство здравоохранения (Ricerca Corrente и Ricerca Finalizzata для GMF, MP и GM), Fondazione Fibrosi Cistica (Progetto FFC # 8/2018 для MP), Regione Lazio (проект «Gruppi di Ricerca» 2018 для MP), Программа стипендий FRIAS COFUND ( Университет Фрайбурга, Германия) и People Program (Действия Марии Кюри) Седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP / 2007-2013) в рамках грантового соглашения REA №609305 (для M.A.), Daunia Plast (для G.M.) и NIH / NIAMS R01 AR070645 (для Y.L. и M.K.-M.). F.R. поддерживается грантами ZonMW VICI (016.130.606), ALW Open Program (ALWOP.310), Фондом Марии Склодовской-Кюри (713660), Мари Склодовской-Кюри ITN (765912) и грантом ZonMW TOP (91217002). М.М. поддерживается программой ALW Open (ALWOP.355). I.O. является стипендиатом долгосрочной докторской стипендии FEBS. Вклад авторов: M.D.R. провел большую часть экспериментов при решающей помощи М.A. (протеомный скрининг и анализы убиквитинирования), C.F. и Б. (создание конструкций Trim32), M.T.P. (Поддержание и подготовка клеток LGMD2H), G.R. (ПЦР в реальном времени и РНК-интерференция), M.C. (Анализ FACS), F.G. и А. (анализ потока аутофагии) и F.C. (продукция и инфекции ретровирусов и лентивирусов). Y.L., R.D.L.T., H.D., I.O. и M.K.-M. провели исследования in vivo. М.М. и Ф. провели электронно-микроскопические исследования. М.Н. и A.F. предоставили фибробласты LGMD2H. M.D. провела трансдифференцировку фибробластов LGMD2H в миобласты.M.D.R. и G.M.F. написал рукопись с помощью и предложениями F.R., G.M. и M.P. G.M., M.P. и G.M.F. задумал и разработал исследование. Все авторы обсудили результаты и прокомментировали рукопись. Конкурирующие интересы: G.M. является оплачиваемым консультантом фармацевтической компании Takeda. Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *