Sven sps 705: Купить Колонки SVEN SPS-705, 2.0, черный в интернет-магазине СИТИЛИНК, цена на Колонки SVEN SPS-705, 2.0, черный (393450)

Пенициллин-связывающие белки класса A не влияют на форму клетки, но восстанавливают дефекты клеточной стенки

Существенные изменения:

1) Авторы должны предоставить более окончательные доказательства, чтобы показать, что PBP1b действительно является «активно» репаративным дефектом клеточной стенки, если бы это было основным выводом, который они хотели бы сделать.Основное доказательство, которое авт. Использовали в поддержку своего вывода о том, что PBP1b активно восстанавливает повреждение клеточной стенки, получено в экспериментах по спасению, где избыточная экспрессия PBP1b спасает клетки с истощенными предшественниками клеточной стенки. Я не совсем понимаю, почему это свидетельство поддерживает «активную» роль PBP1b в восстановлении повреждений. Если авторы используют клеточный штамм, который сверхэкспрессирует систему стержней, заметят ли они подобный эффект? В противном случае у них были бы более убедительные доказательства, подтверждающие их вывод. Но если так, следует ли им сделать вывод, что система стержней также активно ремонтирует повреждения? Эксперимент по вымыванию лекарственного средства и сверхэкспрессии PBP1b действительно показал, что PBP1b имеет решающее значение для восстановления клеток от истощения предшественников, но PBP1b не нуждается в «активном способе» восстановления клеточных дефектов.Они только должны быть функциональными. Если для того, чтобы «продемонстрировать, что PBP1b отвечает на повреждение клеточной стенки», потребуются окончательные доказательства, такие как описанные выше, или доказательства прямого рекрутирования aPBP в области повреждения. Как минимум, авторы должны смягчить такие окончательные утверждения по всему тексту (например, в первом и пятом параграфах Обсуждения).

Мы согласны с авторами обзора в том, что наш вывод об «активной» роли PBP1b как фермента репарации был слишком сильным.Поэтому мы существенно изменили заголовок, аннотацию и текст рукописи. Ниже мы кратко резюмируем то, что, по нашему мнению, может быть твердо заключено, и какая гипотеза подтверждается нашими экспериментами, но не демонстрируется строго.

Во-первых, что касается слова «активный», мы теперь думаем, что это слово нечеткое / неоднозначное и его следует заменить. Фермент активен просто благодаря своей ферментативной активности. Если PBP1b является репаративным ферментом, как мы хотим подтвердить в наших экспериментах, он автоматически является активным репаративным ферментом.Под словом «активный» мы хотели описать потенциальную склонность PBP1b к увеличению активности в ответ на более крупные или более механические дефекты. Однако теперь мы согласны с тем, что на основании наших экспериментов нельзя сделать вывод об увеличении активности.

Мы думаем, что наша работа предоставляет доказательства того, что PBP1b является репаративным ферментом, т.е. что он вставляет PG в места локальных повреждений клеточной стенки. Это должно контрастировать со сценарием, когда PBP1b просто предотвращает образование дефектов, добавляя больше или «лучший» (в смысле более прочный) пептидогликан.Этот вывод подтверждается нашими предыдущими и новыми экспериментами.

a) Экспрессия PBP1b быстро снижает скорость лизиса после временной обработки D-циклосерином – в течение <20 мин после отмывки как в минимальной, так и в богатой средах. В минимальной среде это время составляет менее 30% времени генерации. Таким образом, PBP1b, вероятно, рекрутируется в локальные дефекты клеточной стенки, где он затем служит ферментом репарации. Поэтому мы переместили результаты восстановления, полученные на минимальных носителях (ранее рисунок 4 - добавление к рисунку 3), на основной рисунок и переместили результаты, полученные на расширенных носителях (LB), на дополнительный рисунок (рисунок 3 - добавление к рисунку 3).

Уменьшение лизиса между 10-25 мин после отмывки теперь также демонстрируется с помощью покадровой микроскопии отдельных клеток (новый рисунок 3E-G, см. Также рисунок 3 – приложение к рисунку 4).

D-циклосерином, в свою очередь, снижает среднюю плотность пептидогликана и, таким образом, увеличивает средний размер пор в клеточной стенке. Увеличение размера пор подтверждается новыми экспериментами UPLC, проведенными в сотрудничестве с Felipe Cava (см. Рис. 3A, B), и предыдущими экспериментами по мечению 3H-mDAP, представленными в [Oldewurtel et al., 2019]. Чтобы поддержать это утверждение, мы включили результаты UPLC-УФ-характеристики саккулы после обработки 1 мМ D-циклосерином на фиг. 3B.

Мы не ожидаем, что дефекты клеточной стенки изначально качественно сильно отличаются от дефектов, которые обычно возникают во время обычного роста. Однако эти дефекты, вероятно, ответственны за лизис как во время, так и после лечения D-циклосерином, возможно, потому, что они растут с течением времени. Затем наши эксперименты предполагают, что эти дефекты восстанавливаются с помощью PBP1b после вымывания D-циклосерина.

b) При ограничении предшественников клеточной стенки за счет истощения mDAP или за счет промежуточных (летальных, но ненасыщающих) уровней D-циклосерина мы наблюдаем, что клетки выживают дольше в присутствии PBP1b. Поскольку в этих экспериментах мы ограничиваем синтез предшественников, эти эксперименты предполагают, что PBP1b лучше способен поддерживать механическую стабильность, чем остальные другие ферменты, при тех же ограниченных ресурсах. Это открытие подтверждает предыдущие данные о повышенной чувствительности мутанта ∆1b к антибиотикам, направленным на клеточную стенку.

Мы провели новые эксперименты с мутантом PBP1b *, выделенным лабораторией Бернхардта, который не требует, чтобы LpoB дополнял делецию PBP1a [Markovski et al., 2016; Paradis-Bleau et al., R2010]. Мы использовали этот мутант, чтобы продемонстрировать, что PBP1b с LpoB способствует восстановлению от временного повреждения клеточной стенки (обработка D-циклосерином) по сравнению с PBP1b * ∆LpoB (рисунок 3 – приложение к рисунку 5).

Эта интерпретация дополнительно подтверждается измерениями отслеживания одиночных молекул PBP1b и PBP1b * на фоне ∆LpoB.В обоих случаях связанная фракция молекул сильно снижается (рисунок 4 – приложение к рисунку 4).

Эти наблюдения подтверждают идею, что LpoB служит для ощущения пор в клеточной стенке и что этот механизм восприятия играет роль в восстановлении D-циклосерина, как предполагалось ранее.

2) После истощения предшественников синтез всей клеточной стенки замедляется, поэтому трудно утверждать, что существуют определенные дефекты клеточной стенки – модель в этой области такова, что PBP1b активируется, когда в клеточной стенке есть более крупные поры, поэтому LopB может достигать пор, чтобы активировать PBP1b.Должны ли некоторые гипермутанты амидазы лучше определять эти дефекты, а не использовать лекарственное лечение, которое снижает синтез всей клеточной стенки? (Здесь я предполагаю, что без mDap или D-Ala-D-Ala липид II не будет синтезирован или перевернут). Другой способ решить эту проблему – использовать ВЭЖХ для количественной оценки структуры PG после обработки D-cyc или mDAP, чтобы показать конкретные типы повреждений и сравнить структуры клеточной стенки в клетках WT, и когда PBP1b никогда не индуцируется или всегда индуцируется. Опять же, авторы предоставили доказательства, которые согласуются с текущей моделью, но эти доказательства не являются окончательными.Авторам следует соответствующим образом отредактировать текст, чтобы не делать таких окончательных выводов.

Мы понимаем, что мы используем слово «дефект» неоднозначно. Поэтому мы включили текст, объясняющий, что мы имеем в виду в разделе о ремонте:

«Сниженное сшивание, вероятно, вызывает сопутствующее накопление дефектов, то есть участков с увеличенным размером пор, которые в конечном итоге ответственны за лизис». Мы использовали это слово для обозначения участков возможного лизиса в будущем.Это могут быть поры в клеточной стенке увеличенного размера. Эти дефекты в принципе могут возникать во время регулярного роста (когда они быстро восстанавливаются) или во время остановки внедрения клеточной стенки.

Как описано более подробно в ответ на предыдущий пункт, теперь мы более четко продемонстрировали, что размер пор действительно увеличился. Поэтому мы думаем, что обработка D-циклосерином хорошо подходит для введения дефектов в клеточную стенку и исследования способности PBP1b восстанавливать эти летальные дефекты.

Мы согласны с тем, что наши эксперименты не предоставляют доказательств конкретного механизма PBP1b, как уже обсуждалось выше. Поэтому мы пересмотрели Аннотация, Введение, Результаты и Обсуждение.

3) Название можно было бы изменить, сделав его более конкретным – «PBP класса A способствуют…». Как написано, это кажется очевидным утверждением (конечно, синтазы клеточной стенки, включая RodA / PBP2, вносят вклад в целостность клеточной оболочки; новизна заключается в том, как это делают aPBP).

Согласны с рецензентами.Новое название – «Пенициллин-связывающие белки класса А не влияют на форму клетки, но восстанавливают дефекты клеточной стенки».

(PDF) Поляризация человеческих макрофагов интерлейкином-4 не требует АТФ-цитрат-лиазы

Намгаладзе и соавт. АТФ-цитратлиаза в макрофагах

Фармакологические ингибиторы непригодны из-за активности о-мишени

. Будут ли индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – производные макрофагов

, где возможно создание моделей нокаута

(45), будут более подходящей моделью для изучения метаболической регуляции поляризации макрофагов

по сравнению с острым миелоидным лейкозом

THP-1 ячейки, должны быть обнаружены в ходе будущего расследования

.

ВКЛАД АВТОРА

DN разработал исследование, провел эксперименты, а

написал рукопись. SZ и IF способствовали измерениям ацетил-CoA

. FS, NK и DF способствовали созданию линии нокаутных клеток CRISPR / Cas9

THP-1. BB участвовал в исследовании дизайна

и редактировал окончательную рукопись. Все авторы внесли

в редакцию рукописи, прочитали и одобрили представленную версию

.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft

(SCHN1166 / 4-1): SFB 1039 (Teilprojekt A05, A06, B04), NA

429 / 2-2 и Центром клеток и генов LOEWE. Терапия

по ФС.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Андреа Дюшен и Таню Кепплер за техническую помощь

.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дополнительные материалы к этой статье

можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/ mmu.

2018.02858 / полный # дополнительный материал

ССЫЛКИ

1. Мюррей П.Дж., Аллен Дж.Э., Бисвас С.К., Фишер Э.А., Гилрой Д.В., Гердт С. и др.

Активация и поляризация макрофагов: номенклатура и экспериментальные

рекомендации.Иммунитет (2014) 41: 14–20. doi: 10.1016 / j.immuni.2014.06.008

2. Мартинес Ф.О., Гордон С. Парадигма активации макрофагов M1 и M2:

Время для переоценки. F1000Prime Rep. (2014) 6:13. DOI: 10.12703 / P6-13

3. Миллс К.Д., Кинкейд К., Альт Дж. М., Хейлман М. Дж., Хилл А. М.. M-1 / M-2

макрофагов и парадигма Th2 / Th3. J Immunol. (2000) 164: 6166–73.

doi: 10.4049 / jimmunol.164.12.6166

4. Мантовани А., Соццани С., Локати М., Аллавена П., Сика А.Макрофаг

поляризация: ассоциированные с опухолью макрофаги как парадигма поляризованных мононуклеарных фагоцитов

M2. Trends Immunol. (2002) 23: 549–55.

doi: 10.1016 / S1471-4906 (02) 02302-5

5. Ван ден Босше Дж., О’Нил Л.А., Менон Д. Иммунометаболизм макрофагов:

Куда мы (идем)? Trends Immunol. (2017) 38: 395–406.

doi: 10.1016 / j.it.2017.03.001

6. Фан А.Т., Голдрат А.В., Гласс СК. Метаболическая и эпигенетическая координация

иммунитета Т-клеток и макрофагов.Иммунитет (2017) 46: 714–29.

doi: 10.1016 / j.immuni.2017.04.016

7. Пьетрокола Ф., Галлуцци Л., Браво-Сан Педро Дж. М., Мадео Ф., Кремер Г. Ацетил

коэнзим А: центральный метаболит и второй мессенджер. Cell Metab. (2015)

21: 805–21. DOI: 10.1016 / j.cmet.2015.05.014

8. Сивананд С., Виней И., Веллен К.Э. Пространственно-временной контроль метаболизма ацетил-КоА

в регуляции хроматина. Trends Biochem Sci. (2018) 43: 61–74.

DOI: 10.1016 / j.tibs.2017.11.004

9. Веллен К.Е., Хацивассилиу Г., Сачдева Ю.М., Буй ТВ, Кросс Дж.Р., Томпсон

CB. АТФ-цитратлиаза связывает клеточный метаболизм с ацетилированием гистонов. Наука

(2009) 324: 1076–80. DOI: 10.1126 / science.1164097

10. Bauer DE, Hatzivassiliou G, Zhao F, Andreadis C, Thompson CB. Цитрат АТФ

лиаза является важным компонентом роста и трансформации клеток. Онкоген

(2005) 24: 6314–22. DOI: 10,1038 / sj.onc.1208773

11.Hatzivassiliou G, Zhao F, Bauer DE, Andreadis C, Shaw AN, Dhanak D,

et al. Ингибирование цитратлиазы АТФ может подавлять рост опухолевых клеток. Cancer Cell

(2005) 8: 311–21. DOI: 10.1016 / j.ccr.2005.09.008

12. Каррер А., Пэррис Дж. Л., Трефели С., Генри Р. А., Монтгомери, округ Колумбия, Торрес А. и др.

Влияние диеты с высоким содержанием жиров на уровни ацетилирования ацил-КоА и гистонов в тканях. J

Biol Chem. (2017) 292: 3312–22. DOI: 10.1074 / jbc.M116.750620

13. Das S, Morvan F, Morozzi G, Jourde B, Minetti GC, Kahle P, et al.

Цитратлиаза АТФ регулирует дифференциацию миофибрилл и увеличивает регенерацию

за счет изменения ацетилирования гистонов. Cell Rep. (2017) 21: 3003–11.

doi: 10.1016 / j.celrep.2017.11.038

14. Коваррубиас А.Дж., Аксойлар Х.И., Ю.Дж., Снайдер Н.В., Уорт А.Дж., Айер С.С. и др.

Передача сигналов Akt-mTORC1 регулирует Acly для интеграции метаболических входов в

, контролирующих активацию макрофагов. Элиф (2016) 5: e11612. DOI: 10.7554 / eLife.

11612

15.Ли СП, Каррер А., Шах С., Снайдер Н. В., Вей С., Веннети С. и др. Akt-

-зависимое метаболическое репрограммирование регулирует ацетилирование гистонов опухолевых клеток.

Cell Metab. (2014) 20: 306–19. doi: 10.1016 / j.cmet.2014.06.004

16. Потапова И.А., Эль-Маграби М.Р., Доронин С.В., Бенджамин В.Б. Фосфорилирование

рекомбинантного человеческого АТФ: цитратлиазы с помощью цАМФ-зависимого протеина

киназа отменяет гомотропную аллостерическую регуляцию фермента цитратом

и увеличивает активность фермента.Аллостерическая активация АТФ: цитрат

лиаза фосфорилированными сахарами. Биохимия (2000) 39: 1169–79.

doi: 10.1021 / bi992159y

17. Намгаладзе Д., Брюне Б. Окисление жирных кислот необязательно для поляризации макрофагов человека

, индуцированной ИЛ-4. Biochim Biophys Acta (2014)

1841: 1329–35. doi: 10.1016 / j.bbalip.2014.06.007

18. Энглер К., Кандзия Р., Мариллоннет С. Один горшок, один шаг, точность

с высокой производительностью.PLoS ONE (2008) 3: e3647.

doi: 10.1371 / journal.pone.0003647

19. Ли Дж. Дж., Ван Х., Тино Дж. А., Робл Дж. А., Херпин Т. Ф., Лоуренс Р. М. и др. 2-гидрокси-

N-арилбензолсульфонамиды как ингибиторы АТФ-цитратлиазы. Bioorg Med Chem

Lett. (2007) 17: 3208–11. DOI: 10.1016 / j.bmcl.2007.03.017

20. Гриббл А.Д., Ифе Р.Дж., Шоу А., Макнейр Д., Novelli CE, Бейкуэлл С. и др. ATP-

Цитратлиаза как мишень для гиполипидемического вмешательства. 2. Синтез и оценка

(3R, 5S) -омега-замещенных-3-карбокси-3, 5-дигидроксиалкановых кислот

и их гамма-лактонных пролекарств в качестве ингибиторов фермента

in vitro и in vivo.J Med Chem. (1998) 41: 3582–95. doi: 10.1021 / jm98

0091z

21. Бар-Тана Дж., Роуз-Кан Дж., Сребник М. Ингибирование синтеза липидов бета

бета’-тетраметил-замещенные, C14-C22, альфа, омега-дикарбоновые кислоты в

крыса in vivo.J Biol Chem. (1985) 260: 8404–10.

22. Мариньо Г., Пьетрокола Ф., Айзенберг Т., Конг Ю., Малик С.А., Андрюшкова А.,

et al. Регулирование аутофагии цитозольным ацетил-коферментом A. Mol Cell (2014)

53: 710–25.DOI: 10.1016 / j.molcel.2014.01.016

23. Намгаладзе Д., Снодграсс Р.Г., Ангиони С., Гроссманн Н., Дене Н.,

Гейсслингер Г. и др. AMP-активированная протеинкиназа подавляет экспрессию арахидонат

15-липоксигеназы в интерлейкин-4-поляризованных макрофагах человека. J

Biol Chem. (2015) 290: 24484–94. doi: 10.1074 / jbc.M115.678243

24. Мартинес Ф.О., Гордон С., Локати М., Мантовани А. Транскрипционное профилирование

дифференциации и поляризации человеческих моноцитов и макрофагов: новые

молекул и паттерны экспрессии генов .J Immunol. (2006) 177: 7303–11.

doi: 10.4049 / jimmunol.177.10.7303

25. Гупта С., Джайн А., Сайед С.Н., Снодграсс Р.Г., Пюгер-Мюллер Б., Лейзеганг

МС и др. IL-6 усиливает индуцированную IL-4 поляризацию первичных макрофагов человека

за счет синергии факторов транскрипции STAT3, STAT6 и BATF

. Онкоиммунология (2018) 1–17. doi: 10.1080 / 2162402X.2018.1494110

Границы иммунологии | www.frontiersin.org 10 декабря 2018 г. | Том 9 | Артикул 2858

Восстановление начальных этапов импорта митохондриального белка

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Умеренное увеличение экспрессии Mdr1a / 1b вызывает устойчивость к доксорубицину in vivo на мышиной модели наследственного рака молочной железы

Abstract

Ранее мы обнаружили, что приобретенная устойчивость к доксорубицину на генно-инженерной модели рака молочной железы, связанной с BRCA1, была связана с повышенной экспрессией мышиных генов с множественной лекарственной устойчивостью ( Mdr1 ), которые кодируют АТФ-связывающую кассету переносчика лекарственного препарата. B1 / P-гликопротеин (P-gp).Здесь мы показываем, что даже умеренное увеличение экспрессии Mdr1 (всего в 5 раз) достаточно, чтобы вызвать устойчивость к доксорубицину. Эти умеренно повышенные уровни P-gp в опухоли ниже уровней, обнаруженных в некоторых нормальных тканях, таких как кишечник. Фенотип устойчивости можно полностью обратить вспять с помощью ингибитора P-gp третьего поколения тариквидар, который обеспечивает полезную стратегию для обхода этого типа приобретенной устойчивости к доксорубицину. Присутствие MDR1A в опухолях, устойчивых к лекарствам, с умеренным увеличением количества транскриптов Mdr1a и может быть продемонстрировано с помощью недавно созданного куриного антитела против пептида P-gp мыши.Наши данные показывают полезность реалистичных доклинических моделей для характеристики уровней экспрессии гена Mdr1 , достаточных для возникновения устойчивости. [Cancer Res 2009; 69 (16): 6396–9]

• доксорубицин
• множественная лекарственная устойчивость
• P-гликопротеин
• рак груди
• BRCA1

Введение

Антрациклин доксорубицин часто используется в стандартных режимах адъювантной, неоадъювантной или паллиативной химиотерапии для пациентов с раком груди ( 1).Доксорубицин увеличивает уровень (двухцепочечных) разрывов ДНК, что приводит к гибели клеток. Спонтанные опухоли молочной железы, в которых отсутствует безошибочная гомологически направленная репарация повреждений ДНК, особенно чувствительны к этому препарату ( 2). Однако успешной химиотерапии рака груди препятствует развитие множественной лекарственной устойчивости. В качестве основной причины был идентифицирован ряд различных механизмов, включая изменения в мишени лекарственного средства, накопление / метаболизм лекарственного средства, восстановление ДНК или пути гибели клеток ( 3– 6).Для некоторых из этих механизмов их отношение к устойчивости в реальных опухолях невелико ( 7– 10). Одним из наиболее хорошо охарактеризованных механизмов множественной лекарственной устойчивости in vitro является отток лекарственного средства с помощью переносчиков АТФ-связывающей кассеты (ABC), таких как ABCB1 / MDR1 / P-гликопротеин (P-gp), ABCG2 / BCRP или ABCC1 / MRP1 ( 3). P-gp присутствует в апикальной мембране многих различных нормальных клеток, и его субстратная специфичность широкая ( 11, 12). Тем не менее, актуальность P-gp для клинической множественной лекарственной устойчивости рака груди все еще обсуждается ( 13– 15).Одна проблема, которая поддерживает этот аргумент, – это сложность обнаружения P-gp in situ с использованием фиксированных формалином образцов опухолей. Другая проблема заключается в том, что ингибиторы P-gp принесли лишь умеренную пользу в клинике. Неспецифические ингибиторы первого поколения, такие как верапамил и циклоспорин А, не достигли клинически эффективных уровней в плазме, необходимых для ингибирования P-gp ( 16). Ингибиторы второго поколения, такие как PSC 833 (валсподар), были более эффективными и селективными, но их фармакокинетические взаимодействия с лекарствами часто требовали снижения доз противоопухолевых лекарств.Более селективным ингибитором P-gp третьего поколения является тариквидар (XR9576, Avaant; исх. 17). В нескольких исследованиях не было обнаружено клинически значимого взаимодействия с фармакокинетикой таких агентов, как доксорубицин, винкристин, паклитаксел или винорелбин, хотя (умеренное) увеличение побочных эффектов химиотерапии наблюдалось у пациентов ( 18).

Мы недавно исследовали противоопухолевые лекарственные реакции на генетически модифицированной мышиной модели наследственного рака груди ( K14cre; Brca1 ^{F / F} ; p53 ^{F / F} ; ссылки.2, 19). Опухоли молочной железы, которые спонтанно развиваются в этой модели, имитируют ключевые особенности карциномы молочной железы, ассоциированной с раком молочной железы 1 (BRCA1), у людей. Преимущество этой мышиной модели состоит в том, что эти особенности, а также профили экспрессии отдельных опухолевых генов сохраняются при ортотопической трансплантации небольших фрагментов опухоли сингенным мышам. Поскольку BRCA1 необходим для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации, неудивительно, что протестированные опухоли Brca1 ^{– / –} / p53 ^{– / –} были чувствительны к взаимодействующим с ДНК лекарствам. цисплатин, доксорубицин ( 2) топотекан, ³ и карбоплатин или ингибитор поли (АДФ-рибоза) полимеразы AZD2281 ( 20, 21).Тем не менее, опухоли не удалось ликвидировать, и в конечном итоге они приобрели устойчивость к каждому из протестированных препаратов, за исключением цисплатина и карбоплатина. Основным механизмом приобретения устойчивости к доксорубицину и AZD2281 в этих опухолях была повышенная экспрессия генов Mdr1a и Mdr1b (сокращенно Mdr1 ), которые кодируют мышиный P-gp, переносящий лекарственное средство. Высокая экспрессия Mdr1 была связана с повышенным вымыванием субстрата P-gp ^99m Tc-sestamibi и перекрестной резистентностью к таксану доцетакселу ( 2).Интересно, что мы обнаружили только небольшое (~ 5-кратное) увеличение количества транскриптов Mdr1 и в некоторых опухолях и задались вопросом, достаточно ли этого для объяснения устойчивого фенотипа.

Здесь мы сообщаем, что ~ 5-кратное увеличение по сравнению со средними уровнями транскриптов Mdr1a и Mdr1b необработанных опухолей достаточно, чтобы вызвать устойчивость к доксорубицину. Такие количества намного ниже количества транскриптов, обнаруживаемых в нормальных тканях, таких как кишечник ( Mdr1a ) или почки и надпочечники ( Mdr1b ).В нескольких опухолях, показывающих умеренное увеличение экспрессии гена Mdr1 , уровни P-gp можно было определить с помощью вновь созданного поликлонального антитела.

Материалы и методы

Животные, образование опухолей молочной железы и ортотопические трансплантации сингенным мышам дикого типа. Чувствительность к доксорубицину и резистентность к доксорубицину Brca1 ^{– / –} ; p53 ^{– / –} опухолей молочной железы были образованы в K14cre; Brca1 ^{F / F} ; p53 ^{F / Мыши F} , генотипированные и ортотопически трансплантированные, как описано ( 2, 22).Через 2 недели после трансплантации опухоли начало роста опухоли проверяли не реже трех раз в неделю. Размер опухоли молочной железы определяли штангенциркулем (длина и ширина в мм), а объем опухоли (в мм ³ ) рассчитывали по следующей формуле: 0,5 × длина × ширина ² . Животных умерщвляли CO ₂ , когда объем опухоли достигал 1500 мм ³ . В дополнение к стерильному сбору множества кусочков опухоли для экспериментов по пересадке, образцы опухолей были мгновенно заморожены в жидком азоте и зафиксированы в 4% формалине.Все экспериментальные процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Нидерландского института рака.

Наркотики. Доксорубицин (Adriblastina; Pharmacia Netherlands) разводили до 1 мг / мл в физиологическом растворе (Braun). Тариквидар (Аваант) разводили 5% глюкозой, так что конечный объем, вводимый внутрибрюшинно. инъекция составляла 10 мкл / г массы тела.

Лечение животных с опухолями молочной железы. Когда опухоли молочной железы достигли размера ~ 200 мм ³ , было дано 5 мг доксорубицина i.v. в день 0. Контроли не обрабатывали. Чтобы избежать накопления токсичности повторных инъекций лекарственного средства, дополнительное лечение не проводилось после периода восстановления в 7 дней, когда опухоль реагировала на лечение (размер опухоли <50% от исходного объема, частичный ответ). В этом случае лечение возобновляли после того, как опухоль вернулась к своему первоначальному размеру (100%). Для опухолей с объемом ≥50% после периода восстановления было проведено дополнительное лечение той же дозой, как указано выше.

Мультиплексный анализ амплификации зонда, зависящий от лигирования. Тотальную РНК и ДНК выделяли из мгновенно замороженных образцов опухолей с помощью Trizol (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Реакции мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда (MLPA) на образцах ДНК проводили, как описано ⁴ и используемые олигонуклеотиды указаны в дополнительной таблице S1. Целостность РНК проверяли денатурирующим гель-электрофорезом. Для количественной оценки РНК был проведен анализ обратной транскрипции-MLPA, включающий обратную транскрипцию, гибридизацию, лигирование, амплификацию ПЦР и анализ фрагментов с помощью капиллярного электрофореза, как описано ( 2).Для обнаружения гипоксантин фосфорибозилтрансферазы 1 ( Hprt1 ), мы использовали в качестве CAGGTCAGCAAAGAACT обратной транскрипции праймера (5′-3 ‘) и TCCTCATGGACTGATTATGGACAGGACTGAAAG, ACTTGCTCGAGATGTCATGAAGGAGATGGGAGGCCATCACA и TTGTGGCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGGGCTAT (5′-3’) в качестве целевых специфических последовательностей для реакции лигирования . Для β ₂ -микроглобулин , CTGCGTGCATAAATTGTATAG (5′-3 ‘) использовали в реакции обратной транскрипции, а CATGTGATCAAGCATCATGATGCTCTGAA и GATTCATTTGAACCTGCTATTAATTACA’AATCCAGT ′TC (шаг 5’AATCCAGT) для стадии 5’AATCCAGTTC (5′-3’).

5′-Быстрая амплификация концов кДНК. Общая РНК была экстрагирована из четырех опухолей, устойчивых к доксорубицину, и четырех необработанных опухолей. Была проведена количественная оценка РНК, и был проведен стандартный протокол 5′-быстрой амплификации концов кДНК (5′-RACE) для определения сайта начала транскрипции транскриптов Mdr1a и Mdr1b . Набор Generacer был получен от Invitrogen, и 5′-RACE был выполнен в соответствии с инструкциями производителя. Праймеры были сконструированы так, чтобы они находились в кодирующих областях рядом со стартовым сайтом ATG.Продукты RACE клонировали в вектор TOPO TA (Invitrogen) и трансформировали в бактерии. Множественные клоны (по крайней мере, 20 для каждого эксперимента с 5′-RACE) секвенировали для создания репертуара транскрибируемых последовательностей мРНК, экспрессируемых в каждой опухоли. RACE праймеры (5′-3 ‘): ген-специфического праймера Mdr1a : MseMdr1a JM5: CTTCCCTTAAGGTCCTCTTCAAGTTCC, вложенная праймер Mdr1a : MseMdr1a JM6: AAGTTCCATCACGACCTCACGTGTCTCTACC, ген-специфического праймера mdr1b : MseMdr1b JM7: GAACGTGAAATAATTTGGCTACCTCTTTTTGCCC, вложенная праймер Mdr1b : MseMdr1bnest JM8: TCTGCTCTTCCCTTAAGGTTCTCTTCAAACTCC.Для настройки процедуры мы использовали отобранные винбластином линии клеток макрофагов мыши J774.2 и J7.V1, описанные Гринбергером и его коллегами ( 23) и любезно предоставлены C.P.H. Янг и доктор Сьюзан Б. Горовиц (Медицинский колледж Альберта Эйнштейна).

Вестерн-блоттинг. Образцы опухолей гомогенизировали в 10 ммоль / л KCl, 1,5 ммоль / л MgCl ₂ , 10 ммоль / л Tris-HCI (pH 7,4) и 0,5% (мас. / Об.) SDS с добавлением полных ингибиторов протеазы (Roche). . ДНК разрезали ультразвуком, и образцы, содержащие 50 мкг белка, фракционировали с помощью SDS-PAGE на 7.5% трис-глициновый гель, а затем переносят на нитроцеллюлозную мембрану электроблоттингом. После блоттинга мембраны блокировали в течение не менее 1 часа в TBS (10 ммоль / л Трис, 100 ммоль / л NaCl), содержащем 5% сухого молока и 0,05% Твин, с последующей инкубацией в течение ночи при 4 ° C с антителом C219 при 1,2 мкг / мл. Иммунореактивность визуализировали с помощью кроличьих антимышиных иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой хрена (DakoCytomation; разведение 1: 5 000), с последующим усиленным детектированием хемилюминесценции.

LS9509 антитело. Последовательности мышиных генов Mdr1a и Mdr1b анализировали с помощью алгоритма Хоппа и Вудса для определения потенциальных пептидов для синтеза и продукции антител. Затем пептиды были обработаны методом BLAST для базы данных Swiss-Prot, чтобы определить уникальность и помочь предсказать специфичность полученных антител. Пептид KMGKKSKKEKKEKKPAVSV был выбран и синтезирован, а поликлональные антисыворотки цыплят были созданы в Lifespan Biosciences.Чтобы обеспечить конъюгацию пептида с белком-носителем, остаток цистеина был добавлен к концу NH ₂ пептидов. 77-дневные желтки подвергали пептидной аффинной очистке, и полученные антисыворотки затем использовали в качестве первичных антител, названных LS9509.

Иммуноцитохимия. LLC-PK1 и его соответствующие линии, трансфицированные P-gp, выращенные на предметных стеклах, фиксировали ацетоном при -20 ° C в течение 40 секунд и инкубировали в бессывороточном блоке белка (DakoCytomation) в течение 1 часа.Затем клетки инкубировали в течение ночи с PBS, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин и первичное антитело, которое было либо LS9509, либо C219 (Calbiochem) при конечной концентрации белка 0,26 или 2,9 мкг / мл соответственно. Предметные стекла промывали PBS с последующей инкубацией с соответствующим вторичным антителом, связанным с биотином, в течение 1 часа при разведении 1: 1000 (об. / Об.) И конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена (Vector Laboratories) в течение 30 минут при комнатной температуре. Иммунореакции визуализировали с помощью диаминобензидина (Sigma), а срезы окрашивали гематоксилином.

Иммунофлуоресценция на срезах тканей. Свежеразрезанные замороженные срезы опухолевой ткани мышей толщиной 4 мкм фиксировали ацетоном при -20 ° C в течение 10 мин. Затем срезы блокировали для авидина / биотина (DakoCytomation) в течение 10 минут и в бессывороточном блоке белка (DakoCytomation). Для иммунофлуоресценции C219 были введены дополнительные этапы блокирования для устранения неспецифических взаимодействий с блоком мышь-мышь (набор M.O.M; Vector Laboratories) в соответствии с инструкциями производителя.Затем срезы ткани инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами (0,26 мкг / мл для антитела LS9509 или 11,6 мкг / мл для антитела C219). Предметные стекла промывали PBS с последующей инкубацией с соответствующим вторичным антителом, связанным с биотином, в течение 1 часа при разведении 1: 1000 (об. / Об.) И 30-минутной инкубации со стрептавидином-Cy5 (Invitrogen) в разведении 1 : 50 (об. / Об.) И, наконец, 5-минутная инкубация с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом для окрашивания ядер. Предметные стекла промывали PBS, как описано выше, и помещали в монтажную среду Vectashield (молекулярные зонды).Флуоресценцию Cy5 и 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола в срезах ткани анализировали с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа Leica AOBS.

Результаты

Устойчивость к доксорубицину Brca1 ^{– / –} ; p53 ^{– / –} опухолей с умеренным увеличением экспрессии Mdr1a / Mdr1b может быть обращена ингибитором P-gp tariquidar. В дополнение к опубликованным соотношениям резистентных опухолей к подобранным образцам, взятым до лечения ( 2), мы определили уровни экспрессии гена Mdr1 в доксорубицин-чувствительных и доксорубицин-резистентных опухолях молочной железы мышей по сравнению с выбранными нормальными тканями с помощью обратной транскрипции-MLPA. actinβ, Hprt1 и β ₂ -микроглобулин использовали в качестве эталона, и относительные уровни транскриптов Mdr1 сравнивали с уровнями в печени, кишечнике, надпочечниках и почках, которые, как известно, экспрессируют P-gp. Как показано в рисунок 1 , средний уровень Mdr1 РНК в необработанных опухолях был сопоставим с таковым в селезенке. Интересно, что опухоль 5 (T5), которая имеет уровень РНК в 1,9 и 2,0 раза выше, чем в среднем Mdr1a и Mdr1b для нелеченных опухолей, показала стабильное заболевание в ответ на доксорубицин, тогда как другие опухоли обычно уменьшались в размерах. ответ на лечение ( 2).В устойчивых опухолях по крайней мере в 2 раза повышенные уровни РНК Mdr1 и выше среднего значения Mdr1 для нелеченых опухолей были обнаружены в 11 из 13 опухолей ( Рисунок 1; Дополнительная таблица S2). Mdr1a уровни транскрипта варьировались между уровнями, достигнутыми в печени (T6doxres и T8doxres, в 2-3 раза выше среднего для нелеченных опухолей), двенадцатиперстной кишке (T5doxres, T7doxres и T * 19doxres, в 5-6 раз выше среднее значение для нелеченых опухолей), подвздошной кишки и толстой кишки (T * 4doxres, T * 20doxres, T * 22doxres, T * 23doxres2 и T * 23doxres3, что в 36 раз превышает среднее значение для необработанных опухолей).Что касается транскриптов Mdr1b , только в двух опухолях (T * 23doxres2 и T * 23doxres4) были измерены уровни между уровнями, обнаруженными в почках или надпочечниках (от 31 до 52 раз выше среднего для нелеченных опухолей), но ни одна из них не достигла этих значений. находится в надпочечнике. Таким образом, только одна резистентная к доксорубицину опухоль (T * 22doxres) имела более высокие уровни РНК Mdr1 , чем некоторые нормальные ткани.

Сравнение уровней мРНК Mdr1 с уровнями, обнаруженными в нормальных тканях.Анализ с помощью обратной транскрипции MLPA соотношений экспрессии Mdr1a и Mdr1b в нормальных тканях ( желтый, ), резистентных к доксорубицину опухолях ( красный ) и образцах из соответствующих необработанных опухолей ( синий ). Сумма экспрессии актина β, Hprt1 и β ₂ -микроглобулин ( β ₂ M ) была использована в качестве эталона. Зеленые пунктирные линии, среднее значение Mdr1a / (actinβ + Hprt1 + β ₂ M) и Mdr1b / (actinβ + Hprt1 + β ₂ M) отношения (0.19 и 0,072), обнаруженные в нелеченых опухолях. Колонки, среднее соотношение трех реакций; бар, SD.

При ортотопической трансплантации сингенным животным резистентные к доксорубицину опухоли сохраняли свой фенотип устойчивости или демонстрировали лишь небольшую задержку роста в присутствии доксорубицина (см. 2; Рис. 2 ), тогда как первично чувствительные опухоли значительно сократились ( 2). Чтобы определить важность P-gp в опухолях, резистентных к доксорубицину, мы предварительно обработали мышей ингибитором P-gp тариквидаром ( 17).Когда 10 мг тариквитара / кг в / в. вводили за 15 минут до доксорубицина, животные могли переносить только четыре-пять последующих обработок MTD доксорубицином (5 мг / кг внутривенно, время восстановления минимум 7 дней). Это меньше, чем то, что можно вводить, когда доксорубицин назначается в виде единственного агента (обычно переносятся по крайней мере восемь циклов). Гистологический анализ умерщвленных животных после многократных доз доксорубицина + тариквитара выявил истощение костного мозга как наиболее вероятную причину токсичности (данные не показаны).После первоначальной инъекции в день 0 (объем ∼200 мм ³ ) через 7 дней проводились дополнительные процедуры в случае, если размер опухоли составлял> 50% от размера в день 0. В случае, если опухоль регрессировала до размера менее 50 %, мы возобновили лечение, когда опухоль рецидивировала до 100%. Как показано в Фиг. 2, ингибирование P-gp успешно изменило резистентность к доксорубицину в трех отдельных опухолях, в которых мы обнаружили повышенные уровни мРНК Mdr1 и . T * 23doxres1, в котором не наблюдалось увеличения Mdr1 ( Инжир.1), показал лишь небольшое преимущество предварительной обработки тариквидаром. Несмотря на то, что опухоли снова стали чувствительны к доксорубицину, их не удалось уничтожить комбинацией тариквидар-доксорубицин.

Ответ доксорубицин-резистентных опухолей на доксорубицин в сочетании с тариквидаром. Фрагменты резистентных к доксорубицину опухолей с различным увеличением количества транскриптов Mdr1, (T * 23doxres2, T * 23doxres3 и T7doxres) или без поддающихся обнаружению изменений мРНК Mdr1 (T * 23doxres1) трансплантировали ортотопически сингенным мышам ( и не подвергали лечению). темно-синий ) или обработанные 10 мг тариквитара / кг i.v. ( бирюзовый ), 5 мг доксорубицина / кг в / в. ( розовый ) или 10 мг тариквитара / кг в / в. с последующим 15 мин спустя 5 мг доксорубицина / кг в / в. ( зеленый, оранжевый и коричневый ). В случае, если опухоли не уменьшились <50%, животных отправляли повторно после периода восстановления, равного 7 суткам. Указаны дни, когда животные были возвращены ( белых кружков, треугольников или квадратов ). Если даны планки ошибок (SD), точки данных представляют собой среднее значение трех отдельных животных.Из-за вариабельности рецидивирующих опухолей после комбинаций тариквидар-доксорубицин представлены три отдельные кривые для T * 23doxres2, T * 23doxres3 и T7doxres.

Повышающая регуляция Mdr1 не вызывается амплификацией гена в большинстве опухолей и не коррелирует с использованием дифференциального промотора Mdr1a или Mdr1b . Амплификация MDR1 или его гомологов грызунов наблюдалась во многих линиях клеток с множественной лекарственной устойчивостью (см.4). Напротив, мы не обнаружили увеличения содержания ДНК в 12 из 13 доксорубицин-устойчивых опухолей по сравнению с образцами, взятыми до лечения опухоли (дополнительный рисунок S1). Только для T * 23doxres4 было выявлено увеличение в 1,8 раза. Однако небольшое увеличение числа копий Mdr1 может быть трудно обнаружить в необработанных образцах опухоли. Поэтому мы обогатили опухолевые клетки из двух опухолей, устойчивых к доксорубицину (T * 23doxres2 и T7doxres), путем удаления мертвых клеток, эндотелиальных, фибробластных и гемопоэтических (Lin ⁺ ) клеток после диссоциации опухоли.MLPA-анализ этих клеток Lin ^– не обнаружил какой-либо амплификации Mdr1 (дополнительный рисунок S2). Эти результаты предполагают, что повышенная транскрипция Mdr1 , а не амплификация гена, вызывает повышенную экспрессию Mdr1 в большинстве опухолей.

В образцах опухолей человека и клеточных линиях описаны два типа транскрипционной активации гена MDR1 человека: перестройки ДНК, связывающие ген MDR1 с сильным промотором ( 24, 25) и активация «дистального» промотора на 100 т.п.н. выше гена MDR1 ( 26, 27).В линиях мышиных клеток активация гена Mdr1 также может происходить путем (дефектной) вставки ретровируса ( 28) или перестройками ДНК, которые, как предполагается, являются результатом неравного обмена сестринскими хроматидами, опосредованного повторяющимися элементами LINE-1 ( 29). Чтобы проверить, применим ли какой-либо из этих механизмов к нашим устойчивым опухолям, мы картировали начало транскриптов Mdr1a и Mdr1b , используя протокол 5′-RACE, который позволяет клонировать последовательности, связанные с 5′-кэпом. Результаты, полученные для кэпированных транскриптов четырех отдельных опухолей, устойчивых к доксорубицину, и соответствующих им контролей, чувствительных к доксорубицину, представлены в Инжир.3 . Как для Mdr1a , так и для Mdr1b мы обнаруживаем ряд транскриптов, начинающихся с проксимального промотора, от 132 до 186 нуклеотидов выше ATG в случае Mdr1a и от 116 до 186 нуклеотидов для Mdr1b . Эти стартовые сайты приблизительно совпадают с позициями начала транскрипции, найденными ранее для Mdr1a ( 30, 31) и Mdr1b ( 32, 33) в клеточных линиях и нормальных тканях. В нашей модели нет очевидной разницы между точными стартовыми участками устойчивых и чувствительных опухолей.

Mdr1 5′-RACE доксорубицин-устойчивых и сопоставимых доксорубицин-чувствительных опухолей. A, продукты Mdr1a , выровненные с последовательностью Mdr1a . Числа (в нуклеотидах; нуклеотидов и ) указывают, что каждая опухоль (чувствительная или устойчивая) экспрессирует транскрипты с различной длиной 5′-нетранслируемой области. Длинные транскрипты соответствуют областям, содержащим канонические сайты сплайсинга, далеко перед стартовым сайтом ATG, что указывает на использование дистального стартового сайта транскрипции.Все опухоли (резистентные к доксорубицину и чувствительные к доксорубицину) экспрессируют транскрипты, которые используют либо проксимальные стартовые сайты транскрипции, либо смесь проксимальных и дистальных стартовых сайтов транскрипции. Уровни Mdr1a РНК, полученной из этих опухолей, нормализованы до actinβ, Hprt1 и β2M . B, продукты 5′-RACE Mdr1b , выровненные с последовательностью Mdr1b . Числа (в нуклеотидах) показывают, что каждая опухоль экспрессирует транскрипты с различной длиной 5′-нетранслируемой области.Все опухоли (резистентные к доксорубицину и чувствительные к доксорубицину) экспрессируют транскриптов Mdr1b , которые используют проксимальный сайт старта транскрипции. Уровни Mdr1b РНК, полученной из этих опухолей, нормализованы до актинβ, Hprt1 и β2M .

Анализ доксорубицин-чувствительных и резистентных к доксорубицину опухолей с помощью куриного поликлонального антитела LS9509. A, LLC-PK1 полярные клетки почек свиньи, трансфицированные мышью Mdr1a, Mdr1b или человеческим MDR1 , зондированные LS9509 ( коричневый ). B, срезов головного мозга дикого типа ( wt ) или Mdr1a / b ^{– / –} животных, испытанных с помощью антитела LS9509 ( белый, столбцы 1 и 3; зеленый, столбцы 2 и 4 ). Ядра окрашивали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом ( синий, столбцы 2 и 4). C, OCT мгновенно замороженные слайды опухолей необработанных или резистентных к доксорубицину опухолей, инкубированных с LS9509 ( белый, столбцы 1 и 3; зеленый, столбцы 2 и 4).Ядра окрашивали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом ( синий, столбцы 2 и 4). Все инкубации проводили с антителом LS9509 в конечной концентрации 0,26 мкг / мл.

Обсуждение

В этом исследовании мы показываем, что умеренное увеличение экспрессии генов Mdr1 и , кодирующих P-gp, является достаточным для того, чтобы вызвать приобретенную устойчивость к доксорубицину в реалистичной мышиной модели рака молочной железы, ассоциированного с BRCA1. В нескольких устойчивых опухолях уровни мРНК Mdr1 были всего в 5-13 раз выше среднего уровня Mdr1a или Mdr1b в необработанных опухолях.Уровни в устойчивых опухолях сопоставимы с уровнями, обнаруженными в печени или двенадцатиперстной кишке мышей дикого типа, и мы редко обнаруживали уровни опухолей, превышающие уровни, обычно обнаруживаемые в толстой кишке ( Mdr1a ) или почках ( Mdr1b ). В нормальных тканях пониженная чувствительность к доксорубицину также имеет независимые от P-gp причины, такие как отсутствие механизмов пролиферации или восстановления интактной ДНК. В исследованных опухолях мы уверены, что эти низкие уровни P-gp вызывают резистентность к доксорубицину, поскольку резистентность может быть отменена с помощью ингибитора P-gp третьего поколения тариквидар.Мы пришли к выводу, что в нашей модели опухоли P-gp играет ключевую роль в возникновении лекарственной устойчивости даже в опухолях с 5-кратным увеличением мРНК Mdr1a и Mdr1b . Наша неспособность уничтожить опухоли комбинацией тариквидар-доксорубицин может быть связана с бездействием остаточных клеток, инициирующих опухоль, или другими механизмами ( 44).

До сих пор было трудно показать роль P-gp в лекарственно-устойчивом раке груди in vivo . Например, метаанализ 31 исследования рака молочной железы обнаружил экспрессию P-gp в 41% опухолей и связал трехкратное снижение ответа на химиотерапию с присутствием P-gp ( 45).Тем не менее, к таким исследованиям следует относиться с недоверием из-за огромных различий в определении того, что представляет собой «P-gp-положительная опухоль». Совсем недавно в клинических испытаниях фазы II тарикдар показал ограниченную способность восстанавливать чувствительность к лекарствам у 17 женщин с раком груди III-IV стадии, у которых прогрессировало или имело стабильное заболевание на терапии антрациклином или таксанами ( 46). Только пациент с наибольшим увеличением захвата ^99m Tc-сестамиби, который также продемонстрировал индуцибельную экспрессию P-gp, частично ответил на терапию, содержащую тариквидар.Очевидно, что для увеличения потенциальной пользы от терапии, ингибирующей P-gp, необходим тщательный отбор пациентов. In vivo визуализация с использованием субстрата P-gp ^99m Tc-sestamibi является одним из подходов, и мы также обнаружили повышенное вымывание сестамиби в нашей модели опухоли, устойчивой к доксорубицину ( 2, 47). Однако этот индикатор не является полностью специфичным для P-gp и других насосов для оттока лекарств (например, MRP1; исх. 48), которые не ингибируются P-gp-специфическими транспортными блокаторами, могут давать ложноположительный результат.

Другой подход – это in situ обнаружение с помощью P-gp-специфических антител. Наши попытки создать более чувствительное антитело для окрашивания мышиного P-gp были частично успешными: новое куриное антитело LS9509 обнаруживает только мышиный MDR1A in situ . Тем не менее, восемь резистентных к доксорубицину опухолей с по меньшей мере 5-кратным повышением уровней транскрипта Mdr1a по сравнению с необработанными опухолями были признаны P-gp-положительными, тогда как C219 обнаружил P-gp только в одной из этих опухолей.Возможно, использование блока «мышь-мышь» для C219 является причиной его пониженной чувствительности. Хотя по-прежнему возможно, что другие специфические для человека антитела, у которых отсутствует перекрестная реактивность мыши, лучше работают с образцами человека, может быть полезно создать более чувствительные инструменты для обнаружения P-gp в срезах опухоли. Помимо новых антител, чувствительных как к иммуногистохимии, так и к иммуноблоттингу, усиление сигнала с помощью метода лигирования близости ( 49) – еще один вариант, который можно протестировать и оптимизировать в нашей модели.

Хотя наша модель имитирует ключевые особенности BRCA1-ассоциированного рака молочной железы, она не отражает полной гетерогенности реакции на лечение, наблюдаемой при раке молочной железы. Мы не наблюдали внутренней резистентности к доксорубицину у опухолей, не получавших лекарственные препараты, хотя у людей в ответ на химиотерапию, содержащую антрациклин, часто обнаруживается стабильное или прогрессирующее заболевание. Насколько повышенная экспрессия P-gp способствует первичной устойчивости к химиотерапии у пациентов с раком груди, остается под вопросом.Плохие результаты предварительного лечения тарикдаром у таких пациентов ( 46) не одобряет ключевую роль P-gp. Преимущество нашей модели мыши состоит в том, что мы можем размножаться по Mdr1 -null аллелям ( 43) для выявления Mdr1 -независимых механизмов резистентности к доксорубицину. Будущие исследования опухолей Mdr1 ^{– / –} ; Brca1 ^{– / –} , p53 ^{– / –} должны выявить новые механизмы лекарственной устойчивости, которые также могут быть задействованы в раке груди человека, где ингибирование P-gp не выгодно.

Раскрытие информации о потенциальных конфликтах интересов

A.O.H. Нигрен – сотрудник компании MRC-Holland, которая продает тесты MLPA, используемые в этой статье. Остальные авторы не сообщили о потенциальных конфликтах интересов.

Благодарности

Грантовая поддержка: гранта Голландского онкологического общества в 2006-3566 (П. Борст, С. Роттенберг и Дж. Йонкерс) и 2005-3379 (П. Борст, Р. Бернардс и Р. Л. Бейерсберген), интегрированный проект FP6 Европейского Союза. 037665-ХЕМОРЕС (П.Borst and S. Rottenberg), а также грант Швейцарского фонда грантов в области биологии и медицины PBBEB-104429 (S. Rottenberg).

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

Мы благодарим Альфреда Шинкеля за критическое прочтение рукописи и Сьюзан Бейтс (NIH) за предоставленный тарификатар, и мы благодарны доктору Р.Susan B. Horwitz (Медицинский колледж Альберта Эйнштейна) за предоставление клеточных линий со сверхэкспрессией Mdr1a и Mdr1b , используемых для создания протокола 5′-RACE.

Сноски

• Получено 7 января 2009 г.
• Исправление получено 8 мая 2009 г.
• Принято 3 июня 2009 г.

• © Американская ассоциация исследований рака, 2009 г.

Ссылки

1. ↵

   DeVita VT, Jr., Хеллман С, Розенбург С.А. Рак, принципы и практика онкологии. 6-е изд. Филадельфия: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс, 2001. стр. 3–3235.

2. ↵

   Rottenberg S, Nygren AOH, Pajic M, et al. Селективная индукция устойчивости к химиотерапии опухолей молочной железы в условной мышиной модели наследственного рака молочной железы. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104: 12117–22.

3. ↵

   Szakacs G, Paterson JK, Ludwig JA, Booth-Genthe C, Gottesman MM.Ориентация на множественную лекарственную устойчивость при раке. Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 219–34.

4. ↵

   Fojo T. Множественные пути к фенотипу лекарственной устойчивости: мутации, транслокации, делеции и амплификация кодирующих генов или промоторных областей, эпигенетические изменения и микроРНК. Обновление лекарственного средства 2007; 10: 59–67.

5. Schmitt CA. Старение, апоптоз и терапия – отрезки жизни от рака.Нат Рев Рак 2003; 3: 286–95.

6. ↵

   Voorzanger-Rousselot N, Alberti L, Blay JY. CD40L индуцирует множественную лекарственную устойчивость к апоптозу в клетках карциномы молочной железы и лимфомы через каспазонезависимые и зависимые пути. BMC Рак 2006; 6: 75.

7. ↵

   Brown M, Wilson G. Гены апоптоза и устойчивость к терапии рака: что говорят нам экспериментальные и клинические данные? Рак Biol Ther 2007; 2: 477–90.

8. Браун Дж. М., Аттарди ЛД. Роль апоптоза в развитии рака и ответе на лечение. Нат Рев Рак 2005; 5: 231–7.

9. Borst P, Jonkers J, Rottenberg S. Что делает опухоли множественной лекарственной устойчивостью? Клеточный цикл 2007; 6: 2782–7.

10. ↵

    Ронинсон И.Б., Броуд Э.В., Чанг Б.Д. Если не апоптоз, то что? Вызванное лечением старение и митотическая катастрофа в опухолевых клетках.Обновления Drug Resist 2001; 4: 303–13.

11. ↵

    Devault A, Gros P. Два члена семейства генов mdr мыши придают множественную лекарственную устойчивость с перекрывающимися, но разными лекарственными специфичностями. Mol Cell Biol 1990; 10: 1652–63.

12. ↵

    Уэда К., Кардарелли С., Готтесман М.М., Пастан I. Экспрессия полноразмерной кДНК человеческого гена «MDR1» придает устойчивость к колхицину, доксорубицину и винбластину.Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84: 3004–8.

13. ↵

    Pusztai L. Маркеры, прогнозирующие клиническую пользу при раке груди от агентов, нацеленных на микротрубочки. Анналы онкологии ЕСМО 2007; 18 Дополнение 12: xii15–20.

14. О’Дрисколл Л., Клайнс М. Биомаркеры и множественная лекарственная устойчивость при раке груди. Цели лекарств от рака Curr 2006; 6: 365–84.

15. ↵

    Faneyte IF, Kristel PM, van de Vijver MJ.Определение экспрессии MDR1 / P-гликопротеина при раке груди. Int J Рак 2001; 93: 114–22.

16. ↵

    Raderer M, Scheithauer W. Клинические испытания агентов, обращающих вспять множественную лекарственную устойчивость. Обзор литературы. Рак 1993; 72: 3553–63.

17. ↵

    Мистри П., Стюарт А.Дж., Дэнджерфилд В. и др. In vitro и in vivo Обращение множественной лекарственной устойчивости, опосредованной P-гликопротеином, с помощью нового мощного модулятора XR9576.Рак Res 2001; 61: 749–58.

18. ↵

    Fox E, Bates SE. Тариквидар (XR9576): ингибитор оттока лекарственного средства Р-гликопротеина. Эксперт Rev Anticancer Ther 2007; 7: 447–59.

19. ↵

    Лю Х, Холстедж Х, ван дер Гулден Х и др. Соматическая потеря BRCA1 и p53 у мышей вызывает опухоли молочной железы с патологическими и молекулярными особенностями базального рака молочной железы человека, мутировавшего BRCA1. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104: 12111–6.

20. ↵

    Rottenberg S, Jaspers JE, Kersbergen A, et al. Высокая чувствительность BRCA1-дефицитных опухолей молочной железы к ингибитору PARP AZD2281 отдельно и в комбинации с препаратами платины. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 17079–84.

21. ↵

    Мартин С.А., лорд К.Дж., Эшворт А. Дефицит репарации ДНК как терапевтическая мишень при раке. Curr Opin Genet Dev 2008; 18: 80–6.

22. ↵

    Jonkers J, Meuwissen R, van der Gulden H, Peterse H, Van der Valk M, Berns A.Синергетическая опухолевая супрессорная активность BRCA2 и p53 в условной мышиной модели рака молочной железы. Нат Жене 2001; 29: 418–25.

23. ↵

    Гринбергер Л.М., Лотштейн Л., Уильямс СС, Хорвиц С.Б. Определенные предшественники Р-гликопротеина избыточно продуцируются в независимо изолированных линиях клеток, устойчивых к лекарствам. Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85: 3762–6.

24. ↵

    Микли Л.А., Шпенглер Б.А., Кнутсен Т.А., Бидлер Д.Л., Фоджо Т.Перестройка гена: новый механизм активации гена MDR-1. J Clin Invest 1997; 99: 1947–57.

25. ↵

    Микли Л.А., Ли Дж.С., Вен Зи и др. Генетический полиморфизм в MDR-1: инструмент для изучения экспрессии аллелей в нормальных клетках, линиях клеток, не прошедших отбор и отобранных с помощью лекарств, и опухолях человека. Кровь 1998; 91: 1749–56.

26. ↵

    Chen KG, Wang YC, Schaner ME, et al. Генетическое и эпигенетическое моделирование происхождения клеток с множественной лекарственной устойчивостью в линии клеток саркомы человека.Рак Res 2005; 65: 9388–97.

27. ↵

    Scotto кВт. Транскрипционная регуляция переносчиков лекарств ABC. Онкоген 2003; 22: 7496–511.

28. ↵

    Lepage P, Devault A, Gros P. Активация мышиного гена mdr3 путем вставки ретровируса в опухолевые клетки P388 с множественной лекарственной устойчивостью. Mol Cell Biol 1993; 13: 7380–92.

29. ↵

    Коэн Д., Хигман С.М., Сюй С.И., Хорвиц С.Б.Участие элемента LINE-1 в перестройке ДНК перед геном mdr1a в линии мышиных клеток с множественной лекарственной устойчивостью к таксолу. J Biol Chem 1992; 267: 20248–54.

30. ↵

    Хсу С.И., Коэн Д., Киршнер Л.С., Лотштейн Л., Хартштейн М., Хорвиц С.Б. Структурный анализ промотора mdr1a (P-гликопротеин) мыши выявил основу дифференциальной гетерогенности транскриптов в клетках J774.2 с множественной лекарственной устойчивостью. Mol Cell Biol 1990; 10: 3596–606.

31. ↵

    Lepage P, Raymond M, Nepveu A, Gros P. Активация транскрипции мышиного гена mdr3 совпадает с появлением новых сайтов инициации транскрипции в опухолевых клетках P388 с множественной лекарственной устойчивостью. Рак Res 1993; 53: 1657–64.

32. ↵

    Раймонд М., Грос П. Ген множественной лекарственной устойчивости млекопитающих: корреляция организации экзона со структурными доменами и дупликация предкового гена.Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86: 6488–92.

33. ↵

    Коэн Д., Пикарз Р.Л., Хсу СИ-Х, ДеПиньо Р.А., Карраско Н., Хорвиц С.Б. Структурно-функциональный анализ промотора гена mdr1b мыши. J Biol Chem 1991; 266: 2239–44.

34. ↵

    Huff LM, Lee JS, Robey RW, Fojo T. Характеристика перестроек генов, ведущих к активации MDR-1. J Biol Chem 2006; 281: 36501–9.

35. ↵

    Rao PS, Govindarajan R, Mallya KB, West W, Rao US.Характеристика нового антитела, индуцированного против NH ₂ конца P-гликопротеина. Clin Cancer Res 2005; 11: 5833–9.

36. ↵

    Ши Т., Рин Дж., Ридер Дж., Лю Д., Кольцо ДБ. Высокоаффинные моноклональные антитела против Р-гликопротеина. Клин Иммунол Иммунопатол 1995; 76: 44–51.

37. ↵

    Kartner N, Evernden-Porelle D, Bradley G, Ling V. Обнаружение P-гликопротеина в линиях клеток с множественной лекарственной устойчивостью с помощью моноклональных антител.Природа 1985; 316: 820–3.

38. ↵

    Barrand MA, Twentyman PR. Дифференциальное распознавание продуктов генов mdr1a и mdr1b в линиях опухолевых клеток мышей с множественной лекарственной устойчивостью различными моноклональными антителами. Br J Рак 1992; 65: 239–45.

39. ↵

    Chintamani, Singh JP, Mittal MK, et al. Роль экспрессии P-гликопротеина в прогнозировании ответа на неоадъювантную химиотерапию при раке груди – проспективное клиническое исследование.Мир J Surg Oncol 2005; 3: 61.

40. ↵

    Schinkel AH, Wagenaar E, Van Deemter L, Mol CAAM, Borst P. Отсутствие P-гликопротеина mdr1a у мышей влияет на тканевое распределение и фармакокинетику дексаметазона, дигоксина и циклоспорина A. J Clin Invest 1995; 96: 1698–705.

41. ↵

    Schinkel AH, Borst P. Характеристика человеческого Р-гликопротеина MDR3 и его перекрестная реактивность с моноклональными антителами, специфичными для Р-гликопротеина.Рак Res 1991; 51: 2628–35.

42. ↵

    Джорджес Э., Брэдли Дж., Гариепи Дж., Линг В. Обнаружение изоформ Р-гликопротеина с помощью ген-специфичных моноклональных антител. Proc Natl Acad Sci U S A 1990; 87: 152–6.

43. ↵

    Schinkel AH, Mayer U, Wagenaar E, et al. Нормальная жизнеспособность и измененная фармакокинетика у мышей, лишенных Р-гликопротеинов mdr1-типа (переносящих лекарственные средства). Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94: 4028–33.

44. ↵

    Borst P, Rottenberg S, Jonkers J. Как настоящие опухоли становятся устойчивыми к цисплатину? Клеточный цикл 2008; 7: 1353–9.

45. ↵

    Трок Б.Дж., Леонесса Ф., Кларк Р. Множественная лекарственная устойчивость при раке груди: метаанализ экспрессии MDR1 / gp170 и его возможного функционального значения. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 917–31.

46. ↵

    Pusztai L, Wagner P, Ibrahim N, et al.Фаза II исследования тариквитара, селективного ингибитора Р-гликопротеина, у пациентов с химиотерапевтической резистентной прогрессирующей карциномой молочной железы. Рак 2005; 104: 682–91.

47. ↵

    Van Leeuwen F, Buckle T, Kersbergen A, Rottenberg S, Gilhuijs KG. Неинвазивная функциональная визуализация опосредованной P-гликопротеином устойчивости к доксорубицину на мышиной модели наследственного рака молочной железы для прогнозирования ответа и определения чувствительности к ингибитору P-gp. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2009; 36: 406–12.

48. ↵

    Hendrikse NH, Franssen EJF, Van der Graaf WTA и др. ^99m Tc-sestamibi является субстратом для P-гликопротеина и белка, связанного с множественной лекарственной устойчивостью. Br J Рак 1998; 77: 353–8.

49. ↵

    Содерберг О., Гуллберг М., Ярвиус М. и др. Прямое наблюдение индивидуальных эндогенных белковых комплексов in situ путем лигирования близости. Методы природы 2006; 3: 995–1000.

Адаптация H⁺-накачки и активности плазматической мембраны H⁺-АТФазы в протеоидных корнях белого люпина при дефиците фосфата на JSTOR

Люпин белый (Lupinus albus) способен адаптироваться к дефициту фосфора, производя корни протеидов, которые выделяют огромное количество органических кислот, что приводит к мобилизации труднорастворимых фосфатов почвы в ризосфере. Механизмы, ответственные за высвобождение органических кислот протеоидными клетками корня, особенно процессы трансмембранного транспорта, не выяснены.Из-за высокого цитозольного pH высвобождение недиссоциированных органических кислот маловероятно. В настоящем исследовании мы сосредоточились на экспорте Н + с помощью Н + АТФазы плазматической мембраны в активных корнях протеидов. In vivo закисление ризосферы активных протеоидных корней было чувствительным к ванадату. Плазматические мембраны выделяли из корней протеидов и боковых корней из растений с дефицитом и дефицитом фосфора. In vitro, по сравнению с двумя типами боковых корней и протеоидных корней P-достаточных растений, в активных протеоидных корнях P-дефицитных растений индуцировалось следующее увеличение различных параметров: (a) гидролитическая активность АТФазы, (b) Vmax и Km, (c) концентрация фермента H + АТФазы в плазматической мембране, (d) H + -пампинговая активность, (e) градиент pH через мембрану везикул плазмалеммы и (f) пассивная проницаемость H + плазматической мембраны.Кроме того, были определены более низкая чувствительность к ванадату и более кислый оптимум pH для АТФазы плазматической мембраны активных протеоидных корней. Наши данные подтверждают гипотезу о том, что в активных протеоидных клетках корня Н + и органические анионы экспортируются отдельно, и что модификация Н + АТФазы плазматической мембраны необходима для усиленного закисления ризосферы активными протеоидными корнями.

Основанный в 1926 году, Plant Physiology – международный журнал, посвященный физиологии, биохимии, клеточной и молекулярной биологии, генетике, биофизике и экологической биологии растений.Физиология растений – один из старейших и наиболее уважаемых журналов по науке о растениях.

Oxford University Press – это отделение Оксфордского университета. Издание во всем мире способствует достижению цели университета в области исследований, стипендий и образования. OUP – крупнейшая в мире университетская пресса с самым широким присутствием в мире. В настоящее время он издает более 6000 новых публикаций в год, имеет офисы примерно в пятидесяти странах и насчитывает более 5500 сотрудников по всему миру.