Бпв 1: Электрофидер | Блок предохранитель-выключатель БПВ-1

BPV-1 получали из папиллом крупного рогатого скота, как описано ранее (15). Суспензии вирусов диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 30 минут, а затем диализованный вирус добавляли к протопластам S. cerevisiae в культуре. Для инфицирования 1 мл протопластов S. cerevisiae при 5 × 10 ⁷ клеток / мл подвергали воздействию 1 мкл суспензии очищенных вирионов BPV-1 при оптической плотности при 595 нм (OD ₅₉₅ ). 0,12, ОП, эквивалентная наблюдаемой для бычьего сывороточного альбумина (60 мкг / мл).Таким образом, 5 × 10 ⁷ клеток S. cerevisiae подвергались воздействию 60 нг вирионов BPV-1 или 1,5 × 10 ⁹ частиц вириона, учитывая размер вирионов BPV-1 ∼2 × 10 ⁷ Да, для приблизительной множественности инфекции (MOI) 30: 1.

Препарат ДНК Хирта.

подвергшихся воздействию BPV-1 культур S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt, как описано (25). Переваривание ферментом S. cerevisiae клеток было таким же, как и для S. cerevisiae препарат протопласта. Расщепленные клетки S. cerevisiae промывали 1 М сорбитолом и лизировали в 400 мкл лизатного буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА и 0,2% Тритон Х-100) при комнатной температуре в течение 10 мин. . Затем к лизату добавляли 100 мкл 5 М NaCl и смесь замораживали при -20 ° C в течение 40 мин. Замороженные лизаты размораживали при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученные супернатанты, содержащие вирусную ДНК, инкубировали со 100 мкг протеиназы K при 37 ° C в течение 1 часа.ДНК экстрагировали трис-забуференным фенолом дважды и один раз хлороформом, а затем осаждали этанолом. ДНК расщепляли различными рестрикционными ферментами, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, затем наносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt.

ДНК Hirt разделяли на нейтрально-щелочном двумерном геле (19). ДНК Hirt частично переваривали с помощью Hin dIII в течение 2 ч, а затем подвергали электрофорезу в агарозном геле первого измерения (0. 4%) в буфере TAE (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ EDTA, pH 8,0) при 1,5 В / см в течение 20 часов. Дорожки ДНК прогоняли на агарозном геле второго измерения (1,0% агарозы в стерильной дистиллированной H ₂ O) в щелочном буфере для электрофореза (40 мМ NaOH, 2 мМ EDTA) при 1,5 В / см в течение 24 часов, а затем наносили на нейлоновые мембраны. ДНК-блоты гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Протопласты S. cerevisiae подвергались воздействию вирионов BPV-1, очищенных от бычьих папиллом, и различия в морфологическом внешнем виде протопластов S. cerevisiae наблюдались через несколько часов после воздействия вирионов, которые не наблюдались в неэкспонированных протопластах. В частности, наблюдалось, что многие клетки, подвергшиеся воздействию вирионов, были больше, чем необлученные клетки (рис.).

Морфологические наблюдения и Саузерн-блот-анализ инфицированных BPV-1 S. cerevisiae культура. (A) Морфология протопластов S. cerevisiae после 2 дней культивирования без воздействия вируса BPV-1 и с ним. (B) Регенерация клеточной стенки протопластов S. cerevisiae с воздействием и без воздействия вирионов BPV-1 в различные моменты времени в культуре, как указано, продемонстрированная на нижних панелях путем окрашивания Calcofluor. На верхних панелях в каждом случае показана световая микроскопия одного и того же поля. (C) Просвечивающая электронная микрофотография ядерной секции S.cerevisiae , подвергнутые воздействию вируса BPV-1. NM указывает на ядерную мембрану. Барс, 200 нм. На вставке показано увеличение выделенной части (маленький квадрат) основного изображения, а полоса представляет собой 50 нм. (D) Саузерн-блот-анализ двух штаммов S. cerevisiae , подвергнутых, как показано, воздействию вируса BPV-1 за 48 часов до этого. S. cerevisiae (5 мл; 5 × 10 ⁷ клеток / мл) инфицировали 0,2 мкг вируса BPV-1 и культивировали при осторожном встряхивании при 28 ° C в темноте. Через 24 часа добавляли 5 мл свежей среды. S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt через 48 часов, и 10 мкг ДНК использовали для анализа саузерн-блоттингом. N – круг с надрезом; L, линейный; S, суперспиральная ДНК.

Чтобы определить, может ли геном BPV-1 сохраняться и реплицироваться по крайней мере так же часто, как геном S. cerevisiae в инфицированных BPV-1 S. cerevisiae в долгосрочной культуре, мы исследовали ДНК BPV-1 в S. cerevisiae , инфицированных BPV-1, культивировали в течение длительного периода. S. cerevisiae выращивали при 28 ° C в течение 5 дней и ежедневно субкультивировали, а затем выдерживали при 4 ° C в течение 15 дней.Субкультуру выращивали при 28 ° C и пассировали ежедневно в течение следующих 5 дней. Из этой субкультуры брали другую субкультуру, выдерживали при 4 ° C в течение 25 дней и пассировали ежедневно при 28 ° C в течение следующих 5 дней. Образцы, взятые в различные моменты времени, были использованы для приготовления ДНК Hirt, которая, как и ранее, была протестирована на геном BPV-1 (рис. ).

Чтобы подтвердить репликацию ДНК в S. cerevisiae , мы проанализировали ДНК Hirt, полученную из инфицированных BPV-1 культур S. cerevisiae в нейтральных и щелочных двумерных гелях. Наблюдали типичный образец репликации ДНК BPV-1, включая виды размером 8 т.п.н. и 16 т.п.н. и один репликационный пузырь (рис.).

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур. Всего 10 мкг ДНК Hirt подвергали электрофорезу, как описано в тексте, наносили на нейлон и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1. На левой панели показаны результаты гибридизации блотов первого и второго измерений, а на правой панели показан схематичный образец промежуточных продуктов репликации.

Формат эпизомальной репликации ДНК BPV-1 в культурах

Чтобы охарактеризовать амплифицированную ДНК BPV-1, мы использовали различные комбинации ферментов для ограничения образцов ДНК Hirt, полученных из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур (рис.). Неразрезанная ДНК из краткосрочных и долгосрочных культур показала специфическую гибридизацию с тремя полосами. Форма с надрезом в виде круга была намного сильнее, чем две другие формы во всех трех образцах ДНК Хирта. В ДНК Hirt, полученной из кратковременной зараженной BPV-1 культуры S. cerevisiae (5 дней), семь обработок ферментами рестрикции дали ожидаемые фрагменты ДНК BPV-1, когда блот зондировали с использованием гена L1 BPV-1 ( Рис. А). В Hirt ДНК, полученная из S.cerevisiae (55 дней), ферментные ограничения производили фрагменты, гибридизующиеся с ДНК BPV-1, аналогичные фрагментам из краткосрочной культуры. Также наблюдалась дискретная полоса в 1,5 т.п.н. (стрелка) неопределенного значения (рис. И). Эти результаты подтверждают, что ДНК BPV-1 в краткосрочных и долгосрочных культурах S. cerevisiae сохраняется в виде кольцевой эписомы.

Анализ рестрикционного фермента ДНК Hirt, полученной из инфицированных BPV-1 клеток S. cerevisiae в 5-дневной культуре (A) и 55-дневной культуре (B).Всего 10 мкг ДНК Hirt после расщепления ферментами в течение ночи, как показано, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле (верхние панели), наносили на нейлон и гибридизовали с геном L1 BPV-1, меченным ³² ( нижние панели). (C) Схема, показывающая сайты рестрикции семи ферментов для генома BPV-1 и расположение зонда L1.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что клеток S. cerevisiae могут поглощать вирионы BPV-1 и что вирусная эписома может реплицироваться в инфицированных BPV-1 S.cerevisiae клеток. Это открытие демонстрирует два неожиданных наблюдения: поглощение вируса папилломы клетками S. cerevisiae и репликация эписомы вируса папилломы в S. cerevisiae .

Поглощению папилломавирусов эпителиальными клетками помогают рецепторы на поверхности клетки, включая α ₆ -интегрин (5) и гликозаминогликаны (14). α ₆ -Интегрин необходим для поглощения HPV-6 некоторыми клетками in vitro (16), в то время как гепариноподобные гликозаминогликаны (синдеканы) необходимы для поглощения другими (8).Не известно, что протеогликаны S. cerevisiae включают синдеканы. Сапрофитные дрожжи, однако, экспрессируют интегриноподобные молекулы, которые позволяют клеткам прикрепляться к структурам клеточной поверхности (2), а S. cerevisiae также экспрессирует интегриноподобный белок на клеточной мембране (12). Таким образом, существует возможный механизм связывания вируса папилломы и его захвата протопластами S. cerevisiae с использованием идентифицированного вирусного рецепторного белка.

Мы решили провести наши эксперименты с использованием S.cerevisiae , чтобы максимизировать возможность демонстрации инфекции BPV-1, поскольку мы хотели изучить репликацию папилломавируса в пределах S. cerevisiae , а не процесс поглощения. Неизвестно, может ли связываться и поглощение папилломавируса интактным S. cerevisiae , хотя клеточная мембрана S. cerevisiae доступна для окружающей среды во время деления.

Поддержание стабильности за счет репликации внехромосомной ДНК в S.cerevisiae требует автономных репликационных последовательностей (ARS) (13, 23) и центромерных элементов (CEN) (6, 7). 10 из 11 нуклеотидов совпадают с согласованной основной последовательностью ARS (5 ‘- [A / T] TTTAT [A / G] TTT [A / T] -3’) в геноме BPV-1 (номер доступа J -02044) с нуклеотидами от 7097 до 7087. Другие AT-богатые последовательности могут обеспечивать аналогичную функцию (27), и существует более 50 AT-богатых 12-нуклеотидных последовательностей в геноме BPV-1, который сам относительно богат AT.

Как делящиеся, так и почкующиеся дрожжи могут реплицировать плазмиды, содержащие полный геном BPV-1 вместе с последовательностями ARS и CEN (22), независимо от того, введены ли они в виде круговой или линейной структуры.Кроме того, линеаризованный геном BPV-1 без последовательностей ARS и CEN, но украшенный (T2G4) _n «теломерными» повторами, поддерживался в том же исследовании, что и внехромосомная структура в клетках S. cerevisiae . Таким образом, наши исследования подтверждают это более раннее наблюдение, что геном BPV-1 может заменять ARS и CEN в S. cerevisiae и демонстрирует, что кольцевая эписомальная репликация генома BPV-1 может происходить в отсутствие экзогенных теломерных повторов.

В соответствии с нашими текущими наблюдениями, было замечено, что полноразмерный геном HPV16 при сцеплении в cis с выбираемым S. cerevisiae маркерный ген, либо trp , либо ura , может стабильно реплицироваться в виде эписомы в S. cerevisiae (1). В нашей системе стабильность вирусной плазмиды также была высокой в ​​отсутствие селектируемого маркера, при этом потеря вирусных плазмид не была обнаружена более чем в 13 случаях удвоения популяции.

Вирусы папилломы реплицируются в многослойных тканях плоского эпителия, в которых вирусный геном обнаружен в виде ядерной плазмиды. Вирусные элементы, необходимые для инициации репликации ДНК BPV-1, включают исходную область (20) и два trans -действующих фактора, белки E1 и E2 (21, 24).В настоящем исследовании мы не изучали специфические потребности в продуктах генов папилломавируса для репликации генома папилломавируса, хотя мы наблюдали экспрессию видов мРНК ранних и поздних генов и белка в инфицированных клетках S. cerevisiae (неопубликованные данные ). Анджелетти и др. (1) наблюдали, что геном HPV-16 может реплицироваться в S. cerevisiae без способности транскрибировать какие-либо из его открытых рамок считывания. Ген E2, экспрессируемый в trans , тем не менее увеличивал количество копий генома HPV-16.Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты для установления роли кодируемых вирусом белков, действующих в цис или транс в репликации эписомы BPV-1 в S. cerevisiae .

В заключение, наше исследование вместе с исследованием Angeletti et al. (1) предлагает дальнейшее понимание минимальных требований для репликации внехромосомной ДНК в S. cerevisiae и повышает вероятность того, что S. cerevisiae может действовать как разрешающий хозяин по крайней мере для некоторой части репликативного цикла папилломавируса.Предварительные данные (неопубликованные) предполагают, что белки BPV-1 эффективно экспрессируются в S. cerevisiae после заражения BPV-1, продуцируя вирионы, содержащие эписомальную ДНК BPV-1, и что выход вирионов по крайней мере эквивалентен входящему вирусу.

Благодарности

Эта работа была начата в сотрудничестве с покойным Цзянь Чжоу, который внес значительный вклад в разработку первоначальной экспериментальной работы. Мы благодарим Синь Цзе Чена и Вэнь Цзюнь Лю за полезные обсуждения.

Эта работа частично финансировалась Фондом рака Квинсленда, Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии и Фондом больницы принцессы Александры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Hsiao, C. L., and J. Carbon.

Репликация ДНК бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1) в Saccharomyces cerevisiae после заражения вирионами BPV-1

J Virol.2002 Apr; 76 (7): 3359–3364.

Kong-Nan Zhao

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Госпиталь принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Ян Х. Фрейзер

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Поступила в редакцию 16 октября 2001 г .; Принято 20 декабря 2001 г.

Abstract

Протопласты Saccharomyces cerevisiae , подвергшиеся воздействию вирионов бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1), продемонстрировали поглощение вирионов при электронной микроскопии. Клетки S. cerevisiae выглядели больше после воздействия вирионов BPV-1, и регенерация клеточной стенки замедлялась. Саузерн-блот-гибридизация ДНК Hirt из клеток, подвергшихся воздействию вирионов BPV-1, продемонстрировала ДНК BPV-1, которую можно было обнаружить в течение 80 дней культивирования и по меньшей мере 13 раундов деления. Двумерный гель-анализ ДНК Hirt показал репликативные промежуточные соединения, подтверждая, что геном BPV-1 реплицировался в пределах S. cerevisiae . В препаратах ДНК Hirt из S.cerevisiae , инфицированные в течение более 50 дней, и рестрикционное переваривание показало, что фрагменты гибридизуются с BPV-1 в соответствии с предсказанной рестрикционной картой для кольцевых эписом BPV-1. Эти данные предполагают, что BPV-1 может инфицировать S. cerevisiae и что эписомы BPV-1 могут реплицироваться в инфицированных клетках S. cerevisiae .

Вирусы папилломы представляют собой семейство из более чем 130 генотипов вирусов с двухцепочечной ДНК размером 8 т. п.н., которые используют аппарат репликации ДНК клетки-хозяина вместе с по меньшей мере двумя кодируемыми вирусами неструктурными белками (E1 и E2) для эписомальной репликации своей ДНК в плоский эпителий.Усилия по изучению жизненного цикла вируса и пути заражения были затруднены из-за небольшого количества вируса, продуцируемого в клинических поражениях. Кроме того, ни одна стандартная система культивирования клеток in vitro не является допустимой для вегетативного размножения вируса папилломы человека (ВПЧ), хотя репликация вируса может быть достигнута с низкой эффективностью для некоторых типов вирусов в культуре эпителиального рафта. Кроме того, ни одно маленькое лабораторное животное не является носителем описанной папилломавирусной инфекции. Таким образом, простая система для изучения репликации папилломавируса и продукции инфекционных вирионов может помочь в исследованиях этого онкогенного вируса.

Ткани, инфицированные папилломавирусом, демонстрируют характерный паттерн транскрипции гена папилломавируса в отдельных эпителиальных слоях при исследовании in situ гибридизацией с зондами субгеномной РНК (3, 10, 18). Системы культивирования рафтов подтвердили, что вегетативный жизненный цикл вируса папилломы связан с дифференцировкой эпителия, и продемонстрировали амплификацию вируса, экспрессию поздних генов и продукцию вирионов только в дифференцированных клетках (4, 9, 17), хотя это и является основой ограничения на поздних стадиях. экспрессия генов и вирусная репликация остаются неопределенными.

Использование кодонов в генах папилломавируса больше напоминает использование кодонов дрожжей, чем консенсус млекопитающих (26). Учитывая это, мы предположили, что S. cerevisiae может быть пермиссивным хозяином по крайней мере для некоторой части жизненного цикла папилломавируса in vitro, поскольку мембранные белки дрожжевых клеток включают интегриноподобные молекулы (11), и, таким образом, захват вируса через интегрины ожидал. Репликация генетических элементов в S. cerevisiae зависит от последовательностей ARS (13), и имеется совпадение 10 из 11 нуклеотидов с согласованной последовательностью ARS в геноме BPV-1 на нуклеотиде 7097.

Чтобы проверить, могут ли вирусы папилломы поглощаться клетками S. cerevisiae , и, в частности, может ли эписома вируса папилломы реплицироваться в S. cerevisiae , мы использовали вирионы BPV-1, полученные из бородавок. Поскольку клеточная стенка S. cerevisiae может подавлять инфекцию папилломавируса, мы изучали инфицирование протопластов. Мы сообщаем здесь, что протопластов S. cerevisiae могут захватывать вирионы BPV-1 и что геном BPV-1 эписомально реплицируется в S.cerevisiae через множество клеточных делений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

BPV-1 получали из папиллом крупного рогатого скота, как описано ранее (15). Суспензии вирусов диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 30 минут, а затем диализованный вирус добавляли к протопластам S. cerevisiae в культуре. Для заражения 1 мл S.cerevisiae с концентрацией 5 × 10 ⁷ клеток / мл подвергали воздействию 1 мкл суспензии очищенных вирионов BPV-1 при оптической плотности 0,12 при 595 нм (OD ₅₉₅ ), что эквивалентно OD, наблюдаемой с бычий сывороточный альбумин (60 мкг / мл). Таким образом, 5 × 10 ⁷ клеток S. cerevisiae подвергались воздействию 60 нг вирионов BPV-1 или 1,5 × 10 ⁹ частиц вириона, учитывая размер вирионов BPV-1 ∼2 × 10 ⁷ Да, для приблизительной множественности инфекции (MOI) 30: 1.

Препарат ДНК Хирта.

подвергшихся воздействию BPV-1 культур S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt, как описано (25). Переваривание ферментом клеток S. cerevisiae было таким же, как и для препарата протопластов S. cerevisiae . Расщепленные клетки S. cerevisiae промывали 1 М сорбитолом и лизировали в 400 мкл лизатного буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА и 0,2% Тритон Х-100) при комнатной температуре в течение 10 мин. .Затем к лизату добавляли 100 мкл 5 М NaCl и смесь замораживали при -20 ° C в течение 40 мин. Замороженные лизаты размораживали при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученные супернатанты, содержащие вирусную ДНК, инкубировали со 100 мкг протеиназы K при 37 ° C в течение 1 часа. ДНК экстрагировали трис-забуференным фенолом дважды и один раз хлороформом, а затем осаждали этанолом. ДНК расщепляли различными рестрикционными ферментами, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, затем наносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt.

ДНК Hirt разделяли на нейтрально-щелочном двумерном геле (19). ДНК Hirt частично переваривали Hin dIII в течение 2 часов, а затем подвергали электрофорезу на агарозном геле первого измерения (0,4%) в буфере TAE (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ EDTA, pH 8,0) при 1,5 В / см для 20 ч. Дорожки ДНК обрабатывали на агарозном геле второго измерения (1,0% агароза в стерильной дистиллированной H ₂ O) в щелочном буфере для электрофореза (40 мМ NaOH, 2 мМ EDTA) при 1.5 В / см в течение 24 часов, а затем нанесли на нейлоновые мембраны. ДНК-блоты гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Протопласты S. cerevisiae подвергались воздействию вирионов BPV-1, очищенных от бычьих папиллом, и различия в морфологическом внешнем виде протопластов S. cerevisiae наблюдались через несколько часов после воздействия вирионов, которые не наблюдались в неэкспонированных протопластах.В частности, наблюдалось, что многие клетки, подвергшиеся воздействию вирионов, были больше, чем необлученные клетки (рис.).

Морфологические наблюдения и Саузерн-блот-анализ инфицированной BPV-1 культуры S. cerevisiae . (A) Морфология протопластов S. cerevisiae после 2 дней культивирования без воздействия вируса BPV-1 и с ним. (B) Регенерация клеточной стенки протопластов S. cerevisiae с воздействием и без воздействия вирионов BPV-1 в различные моменты времени в культуре, как указано, продемонстрированная на нижних панелях путем окрашивания Calcofluor.На верхних панелях в каждом случае показана световая микроскопия одного и того же поля. (C) Просвечивающая электронная микрофотография ядерной секции S. cerevisiae , подвергшейся воздействию вируса BPV-1. NM указывает на ядерную мембрану. Барс, 200 нм. На вставке показано увеличение выделенной части (маленький квадрат) основного изображения, а полоса представляет собой 50 нм. (D) Саузерн-блот-анализ двух штаммов S. cerevisiae , подвергнутых, как показано, воздействию вируса BPV-1 за 48 часов до этого. S. cerevisiae (5 мл; 5 × 10 ⁷ клеток / мл) был инфицирован 0.2 мкг вируса BPV-1 и культивирование при осторожном встряхивании при 28 ° C в темноте. Через 24 часа добавляли 5 мл свежей среды. S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt через 48 часов, и 10 мкг ДНК использовали для анализа саузерн-блоттингом. N – круг с надрезом; L, линейный; S, суперспиральная ДНК.

Calcofluor White (4,4′-бис [4-анилино-6-бис [2-гидроксиэтил] амино- s -триазин-2-иламино] -2,2′-стильбендисульфоновая кислота) использовался для исследования клеток. регенерация стен БПВ-1 экспонированная и неэкспонированная S.cerevisiae в культуре (фиг.), и инфицированные BPV-1 клетки S. cerevisiae были намного медленнее, чем неинфицированные клетки S. cerevisiae , регенерировали свою клеточную стенку. Основываясь на наблюдаемых морфологических изменениях, мы искали доказательства поглощения вируса BPV-1 клетками S. cerevisiae с помощью электронной микроскопии тонких срезов и наблюдали интактные вирионы в клетках S. cerevisiae (рис.). Мы также использовали иммунофлуоресцентную микроскопию инфицированного BPV-1 S.cerevisiae , чтобы продемонстрировать белок L1 BPV-1 в ядрах S. cerevisiae , и более 40% клеток S. cerevisiae показали значительное окрашивание L1 через 20 часов после заражения после воздействия вируса на S. cerevisiae с MOI 30: 1.

Для дальнейшего подтверждения поглощения вирионов BPV-1 протопластами S. cerevisiae мы приготовили ДНК супернатанта Hirt (ДНК Hirt) из двух линий S. cerevisiae (Y303 и M2915) до и после воздействия вирионов BPV-1. и исследовали ДНК Hirt на ДНК BPV-1 с помощью саузерн-блоттинга.ДНК-гибридизация с ДНК BPV-1 была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из обеих линий клеток S. cerevisiae после воздействия вируса BPV-1, но не в тех же линиях клеток до воздействия (рис.). Более того, ДНК BPV-1 не была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из клеточных линий S. cerevisiae после воздействия эквивалентного количества вирусной ДНК, экстрагированной из вирионов BPV-1, что позволяет предположить, что голая эписомальная ДНК HPV не поглощается S .cerevisiae клеток.

Затем мы исследовали ДНК BPV-1 в образцах ДНК Hirt, приготовленных из одного S.cerevisiae , Y303, подвергался действию меньшего количества вирионов BPV-1 в различные моменты времени после заражения (рис.). Культуры, инфицированные BPV-1, разделяли каждые 24 часа, и одну треть использовали для получения ДНК Hirt, которую подвергали частичному перевариванию с помощью Hin dIII, которая должна разрезать ДНК BPV-1 в одном месте. Hirt ДНК из зараженных BPV-1 культур S. cerevisiae продемонстрировала специфическую гибридизацию с полосами, соответствующими разорванным кольцевым, линейным и суперспиральным мономерным ДНК BPV-1.Доля суперспиральной ДНК BPV-1 увеличивалась со временем в культуре, тогда как сигналы разорванного круга и линейных мономерных форм уменьшались за тот же период (рис.).

Чтобы определить, может ли геном BPV-1 сохраняться и реплицироваться по крайней мере так же часто, как геном S. cerevisiae в инфицированных BPV-1 S. cerevisiae в долгосрочной культуре, мы исследовали ДНК BPV-1 в БПВ-1-инфицированный S.cerevisiae культивировали в течение длительного периода. S. cerevisiae выращивали при 28 ° C в течение 5 дней и ежедневно субкультивировали, а затем выдерживали при 4 ° C в течение 15 дней. Субкультуру выращивали при 28 ° C и пассировали ежедневно в течение следующих 5 дней. Из этой субкультуры брали другую субкультуру, выдерживали при 4 ° C в течение 25 дней и пассировали ежедневно при 28 ° C в течение следующих 5 дней. Образцы, взятые в различные моменты времени, были использованы для приготовления ДНК Hirt, которая, как и ранее, была протестирована на геном BPV-1 (рис.).

Чтобы подтвердить репликацию ДНК в S. cerevisiae , мы проанализировали ДНК Hirt, полученную из инфицированных BPV-1 культур S. cerevisiae в нейтральных и щелочных двумерных гелях. Наблюдали типичный образец репликации ДНК BPV-1, включая виды размером 8 т.п.н. и 16 т.п.н. и один репликационный пузырь (рис.).

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур. Всего 10 мкг ДНК Hirt подвергали электрофорезу, как описано в тексте, наносили на нейлон и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1. На левой панели показаны результаты гибридизации блотов первого и второго измерений, а на правой панели показан схематичный образец промежуточных продуктов репликации.

Формат эпизомальной репликации ДНК BPV-1 в культурах

Чтобы охарактеризовать амплифицированную ДНК BPV-1, мы использовали различные комбинации ферментов для ограничения образцов ДНК Hirt, полученных из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур (рис.). Неразрезанная ДНК из краткосрочных и долгосрочных культур показала специфическую гибридизацию с тремя полосами. Форма с надрезом в виде круга была намного сильнее, чем две другие формы во всех трех образцах ДНК Хирта. В ДНК Hirt, полученной из кратковременной зараженной BPV-1 культуры S. cerevisiae (5 дней), семь обработок ферментами рестрикции дали ожидаемые фрагменты ДНК BPV-1, когда блот зондировали с использованием гена L1 BPV-1 ( Рис. А). В Hirt ДНК, полученная из S.cerevisiae (55 дней), ферментные ограничения производили фрагменты, гибридизующиеся с ДНК BPV-1, аналогичные фрагментам из краткосрочной культуры. Также наблюдалась дискретная полоса в 1,5 т.п.н. (стрелка) неопределенного значения (рис. И). Эти результаты подтверждают, что ДНК BPV-1 в краткосрочных и долгосрочных культурах S. cerevisiae сохраняется в виде кольцевой эписомы.

Анализ рестрикционного фермента ДНК Hirt, полученной из инфицированных BPV-1 клеток S. cerevisiae в 5-дневной культуре (A) и 55-дневной культуре (B).Всего 10 мкг ДНК Hirt после расщепления ферментами в течение ночи, как показано, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле (верхние панели), наносили на нейлон и гибридизовали с геном L1 BPV-1, меченным ³² ( нижние панели). (C) Схема, показывающая сайты рестрикции семи ферментов для генома BPV-1 и расположение зонда L1.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что клеток S. cerevisiae могут поглощать вирионы BPV-1 и что вирусная эписома может реплицироваться в инфицированных BPV-1 S.cerevisiae клеток. Это открытие демонстрирует два неожиданных наблюдения: поглощение вируса папилломы клетками S. cerevisiae и репликация эписомы вируса папилломы в S. cerevisiae .

Поглощению папилломавирусов эпителиальными клетками помогают рецепторы на поверхности клетки, включая α ₆ -интегрин (5) и гликозаминогликаны (14). α ₆ -Интегрин необходим для поглощения HPV-6 некоторыми клетками in vitro (16), в то время как гепариноподобные гликозаминогликаны (синдеканы) необходимы для поглощения другими (8).Не известно, что протеогликаны S. cerevisiae включают синдеканы. Сапрофитные дрожжи, однако, экспрессируют интегриноподобные молекулы, которые позволяют клеткам прикрепляться к структурам клеточной поверхности (2), а S. cerevisiae также экспрессирует интегриноподобный белок на клеточной мембране (12). Таким образом, существует возможный механизм связывания вируса папилломы и его захвата протопластами S. cerevisiae с использованием идентифицированного вирусного рецепторного белка.

Мы решили провести наши эксперименты с использованием S.cerevisiae , чтобы максимизировать возможность демонстрации инфекции BPV-1, поскольку мы хотели изучить репликацию папилломавируса в пределах S. cerevisiae , а не процесс поглощения. Неизвестно, может ли связываться и поглощение папилломавируса интактным S. cerevisiae , хотя клеточная мембрана S. cerevisiae доступна для окружающей среды во время деления.

Поддержание стабильности за счет репликации внехромосомной ДНК в S.cerevisiae требует автономных репликационных последовательностей (ARS) (13, 23) и центромерных элементов (CEN) (6, 7). 10 из 11 нуклеотидов совпадают с согласованной основной последовательностью ARS (5 ‘- [A / T] TTTAT [A / G] TTT [A / T] -3’) в геноме BPV-1 (номер доступа J -02044) с нуклеотидами от 7097 до 7087. Другие AT-богатые последовательности могут обеспечивать аналогичную функцию (27), и существует более 50 AT-богатых 12-нуклеотидных последовательностей в геноме BPV-1, который сам относительно богат AT.

Как делящиеся, так и почкующиеся дрожжи могут реплицировать плазмиды, содержащие полный геном BPV-1 вместе с последовательностями ARS и CEN (22), независимо от того, введены ли они в виде круговой или линейной структуры.Кроме того, линеаризованный геном BPV-1 без последовательностей ARS и CEN, но украшенный (T2G4) _n «теломерными» повторами, поддерживался в том же исследовании, что и внехромосомная структура в клетках S. cerevisiae . Таким образом, наши исследования подтверждают это более раннее наблюдение, что геном BPV-1 может заменять ARS и CEN в S. cerevisiae и демонстрирует, что кольцевая эписомальная репликация генома BPV-1 может происходить в отсутствие экзогенных теломерных повторов.

В соответствии с нашими текущими наблюдениями, было замечено, что полноразмерный геном HPV16 при сцеплении в cis с выбираемым S.cerevisiae маркерный ген, либо trp , либо ura , может стабильно реплицироваться в виде эписомы в S. cerevisiae (1). В нашей системе стабильность вирусной плазмиды также была высокой в ​​отсутствие селектируемого маркера, при этом потеря вирусных плазмид не была обнаружена более чем в 13 случаях удвоения популяции.

Вирусы папилломы реплицируются в многослойных тканях плоского эпителия, в которых вирусный геном обнаружен в виде ядерной плазмиды. Вирусные элементы, необходимые для инициации репликации ДНК BPV-1, включают исходную область (20) и два trans -действующих фактора, белки E1 и E2 (21, 24).В настоящем исследовании мы не изучали специфические потребности в продуктах генов папилломавируса для репликации генома папилломавируса, хотя мы наблюдали экспрессию видов мРНК ранних и поздних генов и белка в инфицированных клетках S. cerevisiae (неопубликованные данные ). Анджелетти и др. (1) наблюдали, что геном HPV-16 может реплицироваться в S. cerevisiae без способности транскрибировать какие-либо из его открытых рамок считывания. Ген E2, экспрессируемый в trans , тем не менее увеличивал количество копий генома HPV-16.Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты для установления роли кодируемых вирусом белков, действующих в цис или транс в репликации эписомы BPV-1 в S. cerevisiae .

В заключение, наше исследование вместе с исследованием Angeletti et al. (1) предлагает дальнейшее понимание минимальных требований для репликации внехромосомной ДНК в S. cerevisiae и повышает вероятность того, что S. cerevisiae может действовать как разрешающий хозяин по крайней мере для некоторой части репликативного цикла папилломавируса.Предварительные данные (неопубликованные) предполагают, что белки BPV-1 эффективно экспрессируются в S. cerevisiae после заражения BPV-1, продуцируя вирионы, содержащие эписомальную ДНК BPV-1, и что выход вирионов по крайней мере эквивалентен входящему вирусу.

Благодарности

Эта работа была начата в сотрудничестве с покойным Цзянь Чжоу, который внес значительный вклад в разработку первоначальной экспериментальной работы. Мы благодарим Синь Цзе Чена и Вэнь Цзюнь Лю за полезные обсуждения.

Эта работа частично финансировалась Фондом рака Квинсленда, Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии и Фондом больницы принцессы Александры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Репликация ДНК бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1) в Saccharomyces cerevisiae после заражения вирионами BPV-1

J Virol.2002 Apr; 76 (7): 3359–3364.

Kong-Nan Zhao

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Госпиталь принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Ян Х. Фрейзер

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Поступила в редакцию 16 октября 2001 г .; Принято 20 декабря 2001 г.

Abstract

Протопласты Saccharomyces cerevisiae , подвергшиеся воздействию вирионов бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1), продемонстрировали поглощение вирионов при электронной микроскопии. Клетки S. cerevisiae выглядели больше после воздействия вирионов BPV-1, и регенерация клеточной стенки замедлялась. Саузерн-блот-гибридизация ДНК Hirt из клеток, подвергшихся воздействию вирионов BPV-1, продемонстрировала ДНК BPV-1, которую можно было обнаружить в течение 80 дней культивирования и по меньшей мере 13 раундов деления. Двумерный гель-анализ ДНК Hirt показал репликативные промежуточные соединения, подтверждая, что геном BPV-1 реплицировался в пределах S. cerevisiae . В препаратах ДНК Hirt из S.cerevisiae , инфицированные в течение более 50 дней, и рестрикционное переваривание показало, что фрагменты гибридизуются с BPV-1 в соответствии с предсказанной рестрикционной картой для кольцевых эписом BPV-1. Эти данные предполагают, что BPV-1 может инфицировать S. cerevisiae и что эписомы BPV-1 могут реплицироваться в инфицированных клетках S. cerevisiae .

Вирусы папилломы представляют собой семейство из более чем 130 генотипов вирусов с двухцепочечной ДНК размером 8 т.п.н., которые используют аппарат репликации ДНК клетки-хозяина вместе с по меньшей мере двумя кодируемыми вирусами неструктурными белками (E1 и E2) для эписомальной репликации своей ДНК в плоский эпителий.Усилия по изучению жизненного цикла вируса и пути заражения были затруднены из-за небольшого количества вируса, продуцируемого в клинических поражениях. Кроме того, ни одна стандартная система культивирования клеток in vitro не является допустимой для вегетативного размножения вируса папилломы человека (ВПЧ), хотя репликация вируса может быть достигнута с низкой эффективностью для некоторых типов вирусов в культуре эпителиального рафта. Кроме того, ни одно маленькое лабораторное животное не является носителем описанной папилломавирусной инфекции. Таким образом, простая система для изучения репликации папилломавируса и продукции инфекционных вирионов может помочь в исследованиях этого онкогенного вируса.

Ткани, инфицированные папилломавирусом, демонстрируют характерный паттерн транскрипции гена папилломавируса в отдельных эпителиальных слоях при исследовании in situ гибридизацией с зондами субгеномной РНК (3, 10, 18). Системы культивирования рафтов подтвердили, что вегетативный жизненный цикл вируса папилломы связан с дифференцировкой эпителия, и продемонстрировали амплификацию вируса, экспрессию поздних генов и продукцию вирионов только в дифференцированных клетках (4, 9, 17), хотя это и является основой ограничения на поздних стадиях. экспрессия генов и вирусная репликация остаются неопределенными.

Использование кодонов в генах папилломавируса больше напоминает использование кодонов дрожжей, чем консенсус млекопитающих (26). Учитывая это, мы предположили, что S. cerevisiae может быть пермиссивным хозяином по крайней мере для некоторой части жизненного цикла папилломавируса in vitro, поскольку мембранные белки дрожжевых клеток включают интегриноподобные молекулы (11), и, таким образом, захват вируса через интегрины ожидал. Репликация генетических элементов в S. cerevisiae зависит от последовательностей ARS (13), и имеется совпадение 10 из 11 нуклеотидов с согласованной последовательностью ARS в геноме BPV-1 на нуклеотиде 7097.

Чтобы проверить, могут ли вирусы папилломы поглощаться клетками S. cerevisiae , и, в частности, может ли эписома вируса папилломы реплицироваться в S. cerevisiae , мы использовали вирионы BPV-1, полученные из бородавок. Поскольку клеточная стенка S. cerevisiae может подавлять инфекцию папилломавируса, мы изучали инфицирование протопластов. Мы сообщаем здесь, что протопластов S. cerevisiae могут захватывать вирионы BPV-1 и что геном BPV-1 эписомально реплицируется в S.cerevisiae через множество клеточных делений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

BPV-1 получали из папиллом крупного рогатого скота, как описано ранее (15). Суспензии вирусов диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 30 минут, а затем диализованный вирус добавляли к протопластам S. cerevisiae в культуре. Для заражения 1 мл S.cerevisiae с концентрацией 5 × 10 ⁷ клеток / мл подвергали воздействию 1 мкл суспензии очищенных вирионов BPV-1 при оптической плотности 0,12 при 595 нм (OD ₅₉₅ ), что эквивалентно OD, наблюдаемой с бычий сывороточный альбумин (60 мкг / мл). Таким образом, 5 × 10 ⁷ клеток S. cerevisiae подвергались воздействию 60 нг вирионов BPV-1 или 1,5 × 10 ⁹ частиц вириона, учитывая размер вирионов BPV-1 ∼2 × 10 ⁷ Да, для приблизительной множественности инфекции (MOI) 30: 1.

Препарат ДНК Хирта.

подвергшихся воздействию BPV-1 культур S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt, как описано (25). Переваривание ферментом клеток S. cerevisiae было таким же, как и для препарата протопластов S. cerevisiae . Расщепленные клетки S. cerevisiae промывали 1 М сорбитолом и лизировали в 400 мкл лизатного буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА и 0,2% Тритон Х-100) при комнатной температуре в течение 10 мин. .Затем к лизату добавляли 100 мкл 5 М NaCl и смесь замораживали при -20 ° C в течение 40 мин. Замороженные лизаты размораживали при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученные супернатанты, содержащие вирусную ДНК, инкубировали со 100 мкг протеиназы K при 37 ° C в течение 1 часа. ДНК экстрагировали трис-забуференным фенолом дважды и один раз хлороформом, а затем осаждали этанолом. ДНК расщепляли различными рестрикционными ферментами, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, затем наносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt.

ДНК Hirt разделяли на нейтрально-щелочном двумерном геле (19). ДНК Hirt частично переваривали Hin dIII в течение 2 часов, а затем подвергали электрофорезу на агарозном геле первого измерения (0,4%) в буфере TAE (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ EDTA, pH 8,0) при 1,5 В / см для 20 ч. Дорожки ДНК обрабатывали на агарозном геле второго измерения (1,0% агароза в стерильной дистиллированной H ₂ O) в щелочном буфере для электрофореза (40 мМ NaOH, 2 мМ EDTA) при 1.5 В / см в течение 24 часов, а затем нанесли на нейлоновые мембраны. ДНК-блоты гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Протопласты S. cerevisiae подвергались воздействию вирионов BPV-1, очищенных от бычьих папиллом, и различия в морфологическом внешнем виде протопластов S. cerevisiae наблюдались через несколько часов после воздействия вирионов, которые не наблюдались в неэкспонированных протопластах.В частности, наблюдалось, что многие клетки, подвергшиеся воздействию вирионов, были больше, чем необлученные клетки (рис.).

Морфологические наблюдения и Саузерн-блот-анализ инфицированной BPV-1 культуры S. cerevisiae . (A) Морфология протопластов S. cerevisiae после 2 дней культивирования без воздействия вируса BPV-1 и с ним. (B) Регенерация клеточной стенки протопластов S. cerevisiae с воздействием и без воздействия вирионов BPV-1 в различные моменты времени в культуре, как указано, продемонстрированная на нижних панелях путем окрашивания Calcofluor.На верхних панелях в каждом случае показана световая микроскопия одного и того же поля. (C) Просвечивающая электронная микрофотография ядерной секции S. cerevisiae , подвергшейся воздействию вируса BPV-1. NM указывает на ядерную мембрану. Барс, 200 нм. На вставке показано увеличение выделенной части (маленький квадрат) основного изображения, а полоса представляет собой 50 нм. (D) Саузерн-блот-анализ двух штаммов S. cerevisiae , подвергнутых, как показано, воздействию вируса BPV-1 за 48 часов до этого. S. cerevisiae (5 мл; 5 × 10 ⁷ клеток / мл) был инфицирован 0.2 мкг вируса BPV-1 и культивирование при осторожном встряхивании при 28 ° C в темноте. Через 24 часа добавляли 5 мл свежей среды. S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt через 48 часов, и 10 мкг ДНК использовали для анализа саузерн-блоттингом. N – круг с надрезом; L, линейный; S, суперспиральная ДНК.

Calcofluor White (4,4′-бис [4-анилино-6-бис [2-гидроксиэтил] амино- s -триазин-2-иламино] -2,2′-стильбендисульфоновая кислота) использовался для исследования клеток. регенерация стен БПВ-1 экспонированная и неэкспонированная S.cerevisiae в культуре (фиг.), и инфицированные BPV-1 клетки S. cerevisiae были намного медленнее, чем неинфицированные клетки S. cerevisiae , регенерировали свою клеточную стенку. Основываясь на наблюдаемых морфологических изменениях, мы искали доказательства поглощения вируса BPV-1 клетками S. cerevisiae с помощью электронной микроскопии тонких срезов и наблюдали интактные вирионы в клетках S. cerevisiae (рис.). Мы также использовали иммунофлуоресцентную микроскопию инфицированного BPV-1 S.cerevisiae , чтобы продемонстрировать белок L1 BPV-1 в ядрах S. cerevisiae , и более 40% клеток S. cerevisiae показали значительное окрашивание L1 через 20 часов после заражения после воздействия вируса на S. cerevisiae с MOI 30: 1.

Для дальнейшего подтверждения поглощения вирионов BPV-1 протопластами S. cerevisiae мы приготовили ДНК супернатанта Hirt (ДНК Hirt) из двух линий S. cerevisiae (Y303 и M2915) до и после воздействия вирионов BPV-1. и исследовали ДНК Hirt на ДНК BPV-1 с помощью саузерн-блоттинга.ДНК-гибридизация с ДНК BPV-1 была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из обеих линий клеток S. cerevisiae после воздействия вируса BPV-1, но не в тех же линиях клеток до воздействия (рис.). Более того, ДНК BPV-1 не была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из клеточных линий S. cerevisiae после воздействия эквивалентного количества вирусной ДНК, экстрагированной из вирионов BPV-1, что позволяет предположить, что голая эписомальная ДНК HPV не поглощается S .cerevisiae клеток.

Затем мы исследовали ДНК BPV-1 в образцах ДНК Hirt, приготовленных из одного S.cerevisiae , Y303, подвергался действию меньшего количества вирионов BPV-1 в различные моменты времени после заражения (рис.). Культуры, инфицированные BPV-1, разделяли каждые 24 часа, и одну треть использовали для получения ДНК Hirt, которую подвергали частичному перевариванию с помощью Hin dIII, которая должна разрезать ДНК BPV-1 в одном месте. Hirt ДНК из зараженных BPV-1 культур S. cerevisiae продемонстрировала специфическую гибридизацию с полосами, соответствующими разорванным кольцевым, линейным и суперспиральным мономерным ДНК BPV-1.Доля суперспиральной ДНК BPV-1 увеличивалась со временем в культуре, тогда как сигналы разорванного круга и линейных мономерных форм уменьшались за тот же период (рис.).

Чтобы определить, может ли геном BPV-1 сохраняться и реплицироваться по крайней мере так же часто, как геном S. cerevisiae в инфицированных BPV-1 S. cerevisiae в долгосрочной культуре, мы исследовали ДНК BPV-1 в БПВ-1-инфицированный S.cerevisiae культивировали в течение длительного периода. S. cerevisiae выращивали при 28 ° C в течение 5 дней и ежедневно субкультивировали, а затем выдерживали при 4 ° C в течение 15 дней. Субкультуру выращивали при 28 ° C и пассировали ежедневно в течение следующих 5 дней. Из этой субкультуры брали другую субкультуру, выдерживали при 4 ° C в течение 25 дней и пассировали ежедневно при 28 ° C в течение следующих 5 дней. Образцы, взятые в различные моменты времени, были использованы для приготовления ДНК Hirt, которая, как и ранее, была протестирована на геном BPV-1 (рис.).

Чтобы подтвердить репликацию ДНК в S. cerevisiae , мы проанализировали ДНК Hirt, полученную из инфицированных BPV-1 культур S. cerevisiae в нейтральных и щелочных двумерных гелях. Наблюдали типичный образец репликации ДНК BPV-1, включая виды размером 8 т.п.н. и 16 т.п.н. и один репликационный пузырь (рис.).

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур. Всего 10 мкг ДНК Hirt подвергали электрофорезу, как описано в тексте, наносили на нейлон и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1. На левой панели показаны результаты гибридизации блотов первого и второго измерений, а на правой панели показан схематичный образец промежуточных продуктов репликации.

Формат эпизомальной репликации ДНК BPV-1 в культурах

Чтобы охарактеризовать амплифицированную ДНК BPV-1, мы использовали различные комбинации ферментов для ограничения образцов ДНК Hirt, полученных из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур (рис.). Неразрезанная ДНК из краткосрочных и долгосрочных культур показала специфическую гибридизацию с тремя полосами. Форма с надрезом в виде круга была намного сильнее, чем две другие формы во всех трех образцах ДНК Хирта. В ДНК Hirt, полученной из кратковременной зараженной BPV-1 культуры S. cerevisiae (5 дней), семь обработок ферментами рестрикции дали ожидаемые фрагменты ДНК BPV-1, когда блот зондировали с использованием гена L1 BPV-1 ( Рис. А). В Hirt ДНК, полученная из S.cerevisiae (55 дней), ферментные ограничения производили фрагменты, гибридизующиеся с ДНК BPV-1, аналогичные фрагментам из краткосрочной культуры. Также наблюдалась дискретная полоса в 1,5 т.п.н. (стрелка) неопределенного значения (рис. И). Эти результаты подтверждают, что ДНК BPV-1 в краткосрочных и долгосрочных культурах S. cerevisiae сохраняется в виде кольцевой эписомы.

Анализ рестрикционного фермента ДНК Hirt, полученной из инфицированных BPV-1 клеток S. cerevisiae в 5-дневной культуре (A) и 55-дневной культуре (B).Всего 10 мкг ДНК Hirt после расщепления ферментами в течение ночи, как показано, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле (верхние панели), наносили на нейлон и гибридизовали с геном L1 BPV-1, меченным ³² ( нижние панели). (C) Схема, показывающая сайты рестрикции семи ферментов для генома BPV-1 и расположение зонда L1.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что клеток S. cerevisiae могут поглощать вирионы BPV-1 и что вирусная эписома может реплицироваться в инфицированных BPV-1 S.cerevisiae клеток. Это открытие демонстрирует два неожиданных наблюдения: поглощение вируса папилломы клетками S. cerevisiae и репликация эписомы вируса папилломы в S. cerevisiae .

Поглощению папилломавирусов эпителиальными клетками помогают рецепторы на поверхности клетки, включая α ₆ -интегрин (5) и гликозаминогликаны (14). α ₆ -Интегрин необходим для поглощения HPV-6 некоторыми клетками in vitro (16), в то время как гепариноподобные гликозаминогликаны (синдеканы) необходимы для поглощения другими (8).Не известно, что протеогликаны S. cerevisiae включают синдеканы. Сапрофитные дрожжи, однако, экспрессируют интегриноподобные молекулы, которые позволяют клеткам прикрепляться к структурам клеточной поверхности (2), а S. cerevisiae также экспрессирует интегриноподобный белок на клеточной мембране (12). Таким образом, существует возможный механизм связывания вируса папилломы и его захвата протопластами S. cerevisiae с использованием идентифицированного вирусного рецепторного белка.

Мы решили провести наши эксперименты с использованием S.cerevisiae , чтобы максимизировать возможность демонстрации инфекции BPV-1, поскольку мы хотели изучить репликацию папилломавируса в пределах S. cerevisiae , а не процесс поглощения. Неизвестно, может ли связываться и поглощение папилломавируса интактным S. cerevisiae , хотя клеточная мембрана S. cerevisiae доступна для окружающей среды во время деления.

Поддержание стабильности за счет репликации внехромосомной ДНК в S.cerevisiae требует автономных репликационных последовательностей (ARS) (13, 23) и центромерных элементов (CEN) (6, 7). 10 из 11 нуклеотидов совпадают с согласованной основной последовательностью ARS (5 ‘- [A / T] TTTAT [A / G] TTT [A / T] -3’) в геноме BPV-1 (номер доступа J -02044) с нуклеотидами от 7097 до 7087. Другие AT-богатые последовательности могут обеспечивать аналогичную функцию (27), и существует более 50 AT-богатых 12-нуклеотидных последовательностей в геноме BPV-1, который сам относительно богат AT.

Как делящиеся, так и почкующиеся дрожжи могут реплицировать плазмиды, содержащие полный геном BPV-1 вместе с последовательностями ARS и CEN (22), независимо от того, введены ли они в виде круговой или линейной структуры.Кроме того, линеаризованный геном BPV-1 без последовательностей ARS и CEN, но украшенный (T2G4) _n «теломерными» повторами, поддерживался в том же исследовании, что и внехромосомная структура в клетках S. cerevisiae . Таким образом, наши исследования подтверждают это более раннее наблюдение, что геном BPV-1 может заменять ARS и CEN в S. cerevisiae и демонстрирует, что кольцевая эписомальная репликация генома BPV-1 может происходить в отсутствие экзогенных теломерных повторов.

В соответствии с нашими текущими наблюдениями, было замечено, что полноразмерный геном HPV16 при сцеплении в cis с выбираемым S.cerevisiae маркерный ген, либо trp , либо ura , может стабильно реплицироваться в виде эписомы в S. cerevisiae (1). В нашей системе стабильность вирусной плазмиды также была высокой в ​​отсутствие селектируемого маркера, при этом потеря вирусных плазмид не была обнаружена более чем в 13 случаях удвоения популяции.

Вирусы папилломы реплицируются в многослойных тканях плоского эпителия, в которых вирусный геном обнаружен в виде ядерной плазмиды. Вирусные элементы, необходимые для инициации репликации ДНК BPV-1, включают исходную область (20) и два trans -действующих фактора, белки E1 и E2 (21, 24).В настоящем исследовании мы не изучали специфические потребности в продуктах генов папилломавируса для репликации генома папилломавируса, хотя мы наблюдали экспрессию видов мРНК ранних и поздних генов и белка в инфицированных клетках S. cerevisiae (неопубликованные данные ). Анджелетти и др. (1) наблюдали, что геном HPV-16 может реплицироваться в S. cerevisiae без способности транскрибировать какие-либо из его открытых рамок считывания. Ген E2, экспрессируемый в trans , тем не менее увеличивал количество копий генома HPV-16.Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты для установления роли кодируемых вирусом белков, действующих в цис или транс в репликации эписомы BPV-1 в S. cerevisiae .

В заключение, наше исследование вместе с исследованием Angeletti et al. (1) предлагает дальнейшее понимание минимальных требований для репликации внехромосомной ДНК в S. cerevisiae и повышает вероятность того, что S. cerevisiae может действовать как разрешающий хозяин по крайней мере для некоторой части репликативного цикла папилломавируса.Предварительные данные (неопубликованные) предполагают, что белки BPV-1 эффективно экспрессируются в S. cerevisiae после заражения BPV-1, продуцируя вирионы, содержащие эписомальную ДНК BPV-1, и что выход вирионов по крайней мере эквивалентен входящему вирусу.

Благодарности

Эта работа была начата в сотрудничестве с покойным Цзянь Чжоу, который внес значительный вклад в разработку первоначальной экспериментальной работы. Мы благодарим Синь Цзе Чена и Вэнь Цзюнь Лю за полезные обсуждения.

Эта работа частично финансировалась Фондом рака Квинсленда, Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии и Фондом больницы принцессы Александры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Репликация ДНК бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1) в Saccharomyces cerevisiae после заражения вирионами BPV-1

J Virol.2002 Apr; 76 (7): 3359–3364.

Kong-Nan Zhao

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Госпиталь принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Ян Х. Фрейзер

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Поступила в редакцию 16 октября 2001 г .; Принято 20 декабря 2001 г.

Abstract

Протопласты Saccharomyces cerevisiae , подвергшиеся воздействию вирионов бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1), продемонстрировали поглощение вирионов при электронной микроскопии. Клетки S. cerevisiae выглядели больше после воздействия вирионов BPV-1, и регенерация клеточной стенки замедлялась. Саузерн-блот-гибридизация ДНК Hirt из клеток, подвергшихся воздействию вирионов BPV-1, продемонстрировала ДНК BPV-1, которую можно было обнаружить в течение 80 дней культивирования и по меньшей мере 13 раундов деления. Двумерный гель-анализ ДНК Hirt показал репликативные промежуточные соединения, подтверждая, что геном BPV-1 реплицировался в пределах S. cerevisiae . В препаратах ДНК Hirt из S.cerevisiae , инфицированные в течение более 50 дней, и рестрикционное переваривание показало, что фрагменты гибридизуются с BPV-1 в соответствии с предсказанной рестрикционной картой для кольцевых эписом BPV-1. Эти данные предполагают, что BPV-1 может инфицировать S. cerevisiae и что эписомы BPV-1 могут реплицироваться в инфицированных клетках S. cerevisiae .

Вирусы папилломы представляют собой семейство из более чем 130 генотипов вирусов с двухцепочечной ДНК размером 8 т.п.н., которые используют аппарат репликации ДНК клетки-хозяина вместе с по меньшей мере двумя кодируемыми вирусами неструктурными белками (E1 и E2) для эписомальной репликации своей ДНК в плоский эпителий.Усилия по изучению жизненного цикла вируса и пути заражения были затруднены из-за небольшого количества вируса, продуцируемого в клинических поражениях. Кроме того, ни одна стандартная система культивирования клеток in vitro не является допустимой для вегетативного размножения вируса папилломы человека (ВПЧ), хотя репликация вируса может быть достигнута с низкой эффективностью для некоторых типов вирусов в культуре эпителиального рафта. Кроме того, ни одно маленькое лабораторное животное не является носителем описанной папилломавирусной инфекции. Таким образом, простая система для изучения репликации папилломавируса и продукции инфекционных вирионов может помочь в исследованиях этого онкогенного вируса.

Ткани, инфицированные папилломавирусом, демонстрируют характерный паттерн транскрипции гена папилломавируса в отдельных эпителиальных слоях при исследовании in situ гибридизацией с зондами субгеномной РНК (3, 10, 18). Системы культивирования рафтов подтвердили, что вегетативный жизненный цикл вируса папилломы связан с дифференцировкой эпителия, и продемонстрировали амплификацию вируса, экспрессию поздних генов и продукцию вирионов только в дифференцированных клетках (4, 9, 17), хотя это и является основой ограничения на поздних стадиях. экспрессия генов и вирусная репликация остаются неопределенными.

Использование кодонов в генах папилломавируса больше напоминает использование кодонов дрожжей, чем консенсус млекопитающих (26). Учитывая это, мы предположили, что S. cerevisiae может быть пермиссивным хозяином по крайней мере для некоторой части жизненного цикла папилломавируса in vitro, поскольку мембранные белки дрожжевых клеток включают интегриноподобные молекулы (11), и, таким образом, захват вируса через интегрины ожидал. Репликация генетических элементов в S. cerevisiae зависит от последовательностей ARS (13), и имеется совпадение 10 из 11 нуклеотидов с согласованной последовательностью ARS в геноме BPV-1 на нуклеотиде 7097.

Чтобы проверить, могут ли вирусы папилломы поглощаться клетками S. cerevisiae , и, в частности, может ли эписома вируса папилломы реплицироваться в S. cerevisiae , мы использовали вирионы BPV-1, полученные из бородавок. Поскольку клеточная стенка S. cerevisiae может подавлять инфекцию папилломавируса, мы изучали инфицирование протопластов. Мы сообщаем здесь, что протопластов S. cerevisiae могут захватывать вирионы BPV-1 и что геном BPV-1 эписомально реплицируется в S.cerevisiae через множество клеточных делений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

BPV-1 получали из папиллом крупного рогатого скота, как описано ранее (15). Суспензии вирусов диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 30 минут, а затем диализованный вирус добавляли к протопластам S. cerevisiae в культуре. Для заражения 1 мл S.cerevisiae с концентрацией 5 × 10 ⁷ клеток / мл подвергали воздействию 1 мкл суспензии очищенных вирионов BPV-1 при оптической плотности 0,12 при 595 нм (OD ₅₉₅ ), что эквивалентно OD, наблюдаемой с бычий сывороточный альбумин (60 мкг / мл). Таким образом, 5 × 10 ⁷ клеток S. cerevisiae подвергались воздействию 60 нг вирионов BPV-1 или 1,5 × 10 ⁹ частиц вириона, учитывая размер вирионов BPV-1 ∼2 × 10 ⁷ Да, для приблизительной множественности инфекции (MOI) 30: 1.

Препарат ДНК Хирта.

подвергшихся воздействию BPV-1 культур S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt, как описано (25). Переваривание ферментом клеток S. cerevisiae было таким же, как и для препарата протопластов S. cerevisiae . Расщепленные клетки S. cerevisiae промывали 1 М сорбитолом и лизировали в 400 мкл лизатного буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА и 0,2% Тритон Х-100) при комнатной температуре в течение 10 мин. .Затем к лизату добавляли 100 мкл 5 М NaCl и смесь замораживали при -20 ° C в течение 40 мин. Замороженные лизаты размораживали при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученные супернатанты, содержащие вирусную ДНК, инкубировали со 100 мкг протеиназы K при 37 ° C в течение 1 часа. ДНК экстрагировали трис-забуференным фенолом дважды и один раз хлороформом, а затем осаждали этанолом. ДНК расщепляли различными рестрикционными ферментами, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, затем наносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt.

ДНК Hirt разделяли на нейтрально-щелочном двумерном геле (19). ДНК Hirt частично переваривали Hin dIII в течение 2 часов, а затем подвергали электрофорезу на агарозном геле первого измерения (0,4%) в буфере TAE (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ EDTA, pH 8,0) при 1,5 В / см для 20 ч. Дорожки ДНК обрабатывали на агарозном геле второго измерения (1,0% агароза в стерильной дистиллированной H ₂ O) в щелочном буфере для электрофореза (40 мМ NaOH, 2 мМ EDTA) при 1.5 В / см в течение 24 часов, а затем нанесли на нейлоновые мембраны. ДНК-блоты гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Протопласты S. cerevisiae подвергались воздействию вирионов BPV-1, очищенных от бычьих папиллом, и различия в морфологическом внешнем виде протопластов S. cerevisiae наблюдались через несколько часов после воздействия вирионов, которые не наблюдались в неэкспонированных протопластах.В частности, наблюдалось, что многие клетки, подвергшиеся воздействию вирионов, были больше, чем необлученные клетки (рис.).

Морфологические наблюдения и Саузерн-блот-анализ инфицированной BPV-1 культуры S. cerevisiae . (A) Морфология протопластов S. cerevisiae после 2 дней культивирования без воздействия вируса BPV-1 и с ним. (B) Регенерация клеточной стенки протопластов S. cerevisiae с воздействием и без воздействия вирионов BPV-1 в различные моменты времени в культуре, как указано, продемонстрированная на нижних панелях путем окрашивания Calcofluor.На верхних панелях в каждом случае показана световая микроскопия одного и того же поля. (C) Просвечивающая электронная микрофотография ядерной секции S. cerevisiae , подвергшейся воздействию вируса BPV-1. NM указывает на ядерную мембрану. Барс, 200 нм. На вставке показано увеличение выделенной части (маленький квадрат) основного изображения, а полоса представляет собой 50 нм. (D) Саузерн-блот-анализ двух штаммов S. cerevisiae , подвергнутых, как показано, воздействию вируса BPV-1 за 48 часов до этого. S. cerevisiae (5 мл; 5 × 10 ⁷ клеток / мл) был инфицирован 0.2 мкг вируса BPV-1 и культивирование при осторожном встряхивании при 28 ° C в темноте. Через 24 часа добавляли 5 мл свежей среды. S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt через 48 часов, и 10 мкг ДНК использовали для анализа саузерн-блоттингом. N – круг с надрезом; L, линейный; S, суперспиральная ДНК.

Calcofluor White (4,4′-бис [4-анилино-6-бис [2-гидроксиэтил] амино- s -триазин-2-иламино] -2,2′-стильбендисульфоновая кислота) использовался для исследования клеток. регенерация стен БПВ-1 экспонированная и неэкспонированная S.cerevisiae в культуре (фиг.), и инфицированные BPV-1 клетки S. cerevisiae были намного медленнее, чем неинфицированные клетки S. cerevisiae , регенерировали свою клеточную стенку. Основываясь на наблюдаемых морфологических изменениях, мы искали доказательства поглощения вируса BPV-1 клетками S. cerevisiae с помощью электронной микроскопии тонких срезов и наблюдали интактные вирионы в клетках S. cerevisiae (рис.). Мы также использовали иммунофлуоресцентную микроскопию инфицированного BPV-1 S.cerevisiae , чтобы продемонстрировать белок L1 BPV-1 в ядрах S. cerevisiae , и более 40% клеток S. cerevisiae показали значительное окрашивание L1 через 20 часов после заражения после воздействия вируса на S. cerevisiae с MOI 30: 1.

Для дальнейшего подтверждения поглощения вирионов BPV-1 протопластами S. cerevisiae мы приготовили ДНК супернатанта Hirt (ДНК Hirt) из двух линий S. cerevisiae (Y303 и M2915) до и после воздействия вирионов BPV-1. и исследовали ДНК Hirt на ДНК BPV-1 с помощью саузерн-блоттинга.ДНК-гибридизация с ДНК BPV-1 была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из обеих линий клеток S. cerevisiae после воздействия вируса BPV-1, но не в тех же линиях клеток до воздействия (рис.). Более того, ДНК BPV-1 не была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из клеточных линий S. cerevisiae после воздействия эквивалентного количества вирусной ДНК, экстрагированной из вирионов BPV-1, что позволяет предположить, что голая эписомальная ДНК HPV не поглощается S .cerevisiae клеток.

Затем мы исследовали ДНК BPV-1 в образцах ДНК Hirt, приготовленных из одного S.cerevisiae , Y303, подвергался действию меньшего количества вирионов BPV-1 в различные моменты времени после заражения (рис.). Культуры, инфицированные BPV-1, разделяли каждые 24 часа, и одну треть использовали для получения ДНК Hirt, которую подвергали частичному перевариванию с помощью Hin dIII, которая должна разрезать ДНК BPV-1 в одном месте. Hirt ДНК из зараженных BPV-1 культур S. cerevisiae продемонстрировала специфическую гибридизацию с полосами, соответствующими разорванным кольцевым, линейным и суперспиральным мономерным ДНК BPV-1.Доля суперспиральной ДНК BPV-1 увеличивалась со временем в культуре, тогда как сигналы разорванного круга и линейных мономерных форм уменьшались за тот же период (рис.).

Чтобы определить, может ли геном BPV-1 сохраняться и реплицироваться по крайней мере так же часто, как геном S. cerevisiae в инфицированных BPV-1 S. cerevisiae в долгосрочной культуре, мы исследовали ДНК BPV-1 в БПВ-1-инфицированный S.cerevisiae культивировали в течение длительного периода. S. cerevisiae выращивали при 28 ° C в течение 5 дней и ежедневно субкультивировали, а затем выдерживали при 4 ° C в течение 15 дней. Субкультуру выращивали при 28 ° C и пассировали ежедневно в течение следующих 5 дней. Из этой субкультуры брали другую субкультуру, выдерживали при 4 ° C в течение 25 дней и пассировали ежедневно при 28 ° C в течение следующих 5 дней. Образцы, взятые в различные моменты времени, были использованы для приготовления ДНК Hirt, которая, как и ранее, была протестирована на геном BPV-1 (рис.).

Чтобы подтвердить репликацию ДНК в S. cerevisiae , мы проанализировали ДНК Hirt, полученную из инфицированных BPV-1 культур S. cerevisiae в нейтральных и щелочных двумерных гелях. Наблюдали типичный образец репликации ДНК BPV-1, включая виды размером 8 т.п.н. и 16 т.п.н. и один репликационный пузырь (рис.).

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур. Всего 10 мкг ДНК Hirt подвергали электрофорезу, как описано в тексте, наносили на нейлон и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1. На левой панели показаны результаты гибридизации блотов первого и второго измерений, а на правой панели показан схематичный образец промежуточных продуктов репликации.

Формат эпизомальной репликации ДНК BPV-1 в культурах

Чтобы охарактеризовать амплифицированную ДНК BPV-1, мы использовали различные комбинации ферментов для ограничения образцов ДНК Hirt, полученных из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур (рис.). Неразрезанная ДНК из краткосрочных и долгосрочных культур показала специфическую гибридизацию с тремя полосами. Форма с надрезом в виде круга была намного сильнее, чем две другие формы во всех трех образцах ДНК Хирта. В ДНК Hirt, полученной из кратковременной зараженной BPV-1 культуры S. cerevisiae (5 дней), семь обработок ферментами рестрикции дали ожидаемые фрагменты ДНК BPV-1, когда блот зондировали с использованием гена L1 BPV-1 ( Рис. А). В Hirt ДНК, полученная из S.cerevisiae (55 дней), ферментные ограничения производили фрагменты, гибридизующиеся с ДНК BPV-1, аналогичные фрагментам из краткосрочной культуры. Также наблюдалась дискретная полоса в 1,5 т.п.н. (стрелка) неопределенного значения (рис. И). Эти результаты подтверждают, что ДНК BPV-1 в краткосрочных и долгосрочных культурах S. cerevisiae сохраняется в виде кольцевой эписомы.

Анализ рестрикционного фермента ДНК Hirt, полученной из инфицированных BPV-1 клеток S. cerevisiae в 5-дневной культуре (A) и 55-дневной культуре (B).Всего 10 мкг ДНК Hirt после расщепления ферментами в течение ночи, как показано, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле (верхние панели), наносили на нейлон и гибридизовали с геном L1 BPV-1, меченным ³² ( нижние панели). (C) Схема, показывающая сайты рестрикции семи ферментов для генома BPV-1 и расположение зонда L1.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что клеток S. cerevisiae могут поглощать вирионы BPV-1 и что вирусная эписома может реплицироваться в инфицированных BPV-1 S.cerevisiae клеток. Это открытие демонстрирует два неожиданных наблюдения: поглощение вируса папилломы клетками S. cerevisiae и репликация эписомы вируса папилломы в S. cerevisiae .

Поглощению папилломавирусов эпителиальными клетками помогают рецепторы на поверхности клетки, включая α ₆ -интегрин (5) и гликозаминогликаны (14). α ₆ -Интегрин необходим для поглощения HPV-6 некоторыми клетками in vitro (16), в то время как гепариноподобные гликозаминогликаны (синдеканы) необходимы для поглощения другими (8).Не известно, что протеогликаны S. cerevisiae включают синдеканы. Сапрофитные дрожжи, однако, экспрессируют интегриноподобные молекулы, которые позволяют клеткам прикрепляться к структурам клеточной поверхности (2), а S. cerevisiae также экспрессирует интегриноподобный белок на клеточной мембране (12). Таким образом, существует возможный механизм связывания вируса папилломы и его захвата протопластами S. cerevisiae с использованием идентифицированного вирусного рецепторного белка.

Мы решили провести наши эксперименты с использованием S.cerevisiae , чтобы максимизировать возможность демонстрации инфекции BPV-1, поскольку мы хотели изучить репликацию папилломавируса в пределах S. cerevisiae , а не процесс поглощения. Неизвестно, может ли связываться и поглощение папилломавируса интактным S. cerevisiae , хотя клеточная мембрана S. cerevisiae доступна для окружающей среды во время деления.

Поддержание стабильности за счет репликации внехромосомной ДНК в S.cerevisiae требует автономных репликационных последовательностей (ARS) (13, 23) и центромерных элементов (CEN) (6, 7). 10 из 11 нуклеотидов совпадают с согласованной основной последовательностью ARS (5 ‘- [A / T] TTTAT [A / G] TTT [A / T] -3’) в геноме BPV-1 (номер доступа J -02044) с нуклеотидами от 7097 до 7087. Другие AT-богатые последовательности могут обеспечивать аналогичную функцию (27), и существует более 50 AT-богатых 12-нуклеотидных последовательностей в геноме BPV-1, который сам относительно богат AT.

Как делящиеся, так и почкующиеся дрожжи могут реплицировать плазмиды, содержащие полный геном BPV-1 вместе с последовательностями ARS и CEN (22), независимо от того, введены ли они в виде круговой или линейной структуры.Кроме того, линеаризованный геном BPV-1 без последовательностей ARS и CEN, но украшенный (T2G4) _n «теломерными» повторами, поддерживался в том же исследовании, что и внехромосомная структура в клетках S. cerevisiae . Таким образом, наши исследования подтверждают это более раннее наблюдение, что геном BPV-1 может заменять ARS и CEN в S. cerevisiae и демонстрирует, что кольцевая эписомальная репликация генома BPV-1 может происходить в отсутствие экзогенных теломерных повторов.

В соответствии с нашими текущими наблюдениями, было замечено, что полноразмерный геном HPV16 при сцеплении в cis с выбираемым S.cerevisiae маркерный ген, либо trp , либо ura , может стабильно реплицироваться в виде эписомы в S. cerevisiae (1). В нашей системе стабильность вирусной плазмиды также была высокой в ​​отсутствие селектируемого маркера, при этом потеря вирусных плазмид не была обнаружена более чем в 13 случаях удвоения популяции.

Вирусы папилломы реплицируются в многослойных тканях плоского эпителия, в которых вирусный геном обнаружен в виде ядерной плазмиды. Вирусные элементы, необходимые для инициации репликации ДНК BPV-1, включают исходную область (20) и два trans -действующих фактора, белки E1 и E2 (21, 24).В настоящем исследовании мы не изучали специфические потребности в продуктах генов папилломавируса для репликации генома папилломавируса, хотя мы наблюдали экспрессию видов мРНК ранних и поздних генов и белка в инфицированных клетках S. cerevisiae (неопубликованные данные ). Анджелетти и др. (1) наблюдали, что геном HPV-16 может реплицироваться в S. cerevisiae без способности транскрибировать какие-либо из его открытых рамок считывания. Ген E2, экспрессируемый в trans , тем не менее увеличивал количество копий генома HPV-16.Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты для установления роли кодируемых вирусом белков, действующих в цис или транс в репликации эписомы BPV-1 в S. cerevisiae .

В заключение, наше исследование вместе с исследованием Angeletti et al. (1) предлагает дальнейшее понимание минимальных требований для репликации внехромосомной ДНК в S. cerevisiae и повышает вероятность того, что S. cerevisiae может действовать как разрешающий хозяин по крайней мере для некоторой части репликативного цикла папилломавируса.Предварительные данные (неопубликованные) предполагают, что белки BPV-1 эффективно экспрессируются в S. cerevisiae после заражения BPV-1, продуцируя вирионы, содержащие эписомальную ДНК BPV-1, и что выход вирионов по крайней мере эквивалентен входящему вирусу.

Благодарности

Эта работа была начата в сотрудничестве с покойным Цзянь Чжоу, который внес значительный вклад в разработку первоначальной экспериментальной работы. Мы благодарим Синь Цзе Чена и Вэнь Цзюнь Лю за полезные обсуждения.

Эта работа частично финансировалась Фондом рака Квинсленда, Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии и Фондом больницы принцессы Александры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Репликация ДНК бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1) в Saccharomyces cerevisiae после заражения вирионами BPV-1

J Virol.2002 Apr; 76 (7): 3359–3364.

Kong-Nan Zhao

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Госпиталь принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Ян Х. Фрейзер

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Центр иммунологии и исследований рака, Университет Квинсленда, Больница принцессы Александры, Брисбен, Квинсленд 4102, Австралия

Поступила в редакцию 16 октября 2001 г .; Принято 20 декабря 2001 г.

Abstract

Протопласты Saccharomyces cerevisiae , подвергшиеся воздействию вирионов бычьего папилломавируса типа 1 (BPV-1), продемонстрировали поглощение вирионов при электронной микроскопии. Клетки S. cerevisiae выглядели больше после воздействия вирионов BPV-1, и регенерация клеточной стенки замедлялась. Саузерн-блот-гибридизация ДНК Hirt из клеток, подвергшихся воздействию вирионов BPV-1, продемонстрировала ДНК BPV-1, которую можно было обнаружить в течение 80 дней культивирования и по меньшей мере 13 раундов деления. Двумерный гель-анализ ДНК Hirt показал репликативные промежуточные соединения, подтверждая, что геном BPV-1 реплицировался в пределах S. cerevisiae . В препаратах ДНК Hirt из S.cerevisiae , инфицированные в течение более 50 дней, и рестрикционное переваривание показало, что фрагменты гибридизуются с BPV-1 в соответствии с предсказанной рестрикционной картой для кольцевых эписом BPV-1. Эти данные предполагают, что BPV-1 может инфицировать S. cerevisiae и что эписомы BPV-1 могут реплицироваться в инфицированных клетках S. cerevisiae .

Вирусы папилломы представляют собой семейство из более чем 130 генотипов вирусов с двухцепочечной ДНК размером 8 т.п.н., которые используют аппарат репликации ДНК клетки-хозяина вместе с по меньшей мере двумя кодируемыми вирусами неструктурными белками (E1 и E2) для эписомальной репликации своей ДНК в плоский эпителий.Усилия по изучению жизненного цикла вируса и пути заражения были затруднены из-за небольшого количества вируса, продуцируемого в клинических поражениях. Кроме того, ни одна стандартная система культивирования клеток in vitro не является допустимой для вегетативного размножения вируса папилломы человека (ВПЧ), хотя репликация вируса может быть достигнута с низкой эффективностью для некоторых типов вирусов в культуре эпителиального рафта. Кроме того, ни одно маленькое лабораторное животное не является носителем описанной папилломавирусной инфекции. Таким образом, простая система для изучения репликации папилломавируса и продукции инфекционных вирионов может помочь в исследованиях этого онкогенного вируса.

Ткани, инфицированные папилломавирусом, демонстрируют характерный паттерн транскрипции гена папилломавируса в отдельных эпителиальных слоях при исследовании in situ гибридизацией с зондами субгеномной РНК (3, 10, 18). Системы культивирования рафтов подтвердили, что вегетативный жизненный цикл вируса папилломы связан с дифференцировкой эпителия, и продемонстрировали амплификацию вируса, экспрессию поздних генов и продукцию вирионов только в дифференцированных клетках (4, 9, 17), хотя это и является основой ограничения на поздних стадиях. экспрессия генов и вирусная репликация остаются неопределенными.

Использование кодонов в генах папилломавируса больше напоминает использование кодонов дрожжей, чем консенсус млекопитающих (26). Учитывая это, мы предположили, что S. cerevisiae может быть пермиссивным хозяином по крайней мере для некоторой части жизненного цикла папилломавируса in vitro, поскольку мембранные белки дрожжевых клеток включают интегриноподобные молекулы (11), и, таким образом, захват вируса через интегрины ожидал. Репликация генетических элементов в S. cerevisiae зависит от последовательностей ARS (13), и имеется совпадение 10 из 11 нуклеотидов с согласованной последовательностью ARS в геноме BPV-1 на нуклеотиде 7097.

Чтобы проверить, могут ли вирусы папилломы поглощаться клетками S. cerevisiae , и, в частности, может ли эписома вируса папилломы реплицироваться в S. cerevisiae , мы использовали вирионы BPV-1, полученные из бородавок. Поскольку клеточная стенка S. cerevisiae может подавлять инфекцию папилломавируса, мы изучали инфицирование протопластов. Мы сообщаем здесь, что протопластов S. cerevisiae могут захватывать вирионы BPV-1 и что геном BPV-1 эписомально реплицируется в S.cerevisiae через множество клеточных делений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

BPV-1 получали из папиллом крупного рогатого скота, как описано ранее (15). Суспензии вирусов диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 30 минут, а затем диализованный вирус добавляли к протопластам S. cerevisiae в культуре. Для заражения 1 мл S.cerevisiae с концентрацией 5 × 10 ⁷ клеток / мл подвергали воздействию 1 мкл суспензии очищенных вирионов BPV-1 при оптической плотности 0,12 при 595 нм (OD ₅₉₅ ), что эквивалентно OD, наблюдаемой с бычий сывороточный альбумин (60 мкг / мл). Таким образом, 5 × 10 ⁷ клеток S. cerevisiae подвергались воздействию 60 нг вирионов BPV-1 или 1,5 × 10 ⁹ частиц вириона, учитывая размер вирионов BPV-1 ∼2 × 10 ⁷ Да, для приблизительной множественности инфекции (MOI) 30: 1.

Препарат ДНК Хирта.

подвергшихся воздействию BPV-1 культур S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt, как описано (25). Переваривание ферментом клеток S. cerevisiae было таким же, как и для препарата протопластов S. cerevisiae . Расщепленные клетки S. cerevisiae промывали 1 М сорбитолом и лизировали в 400 мкл лизатного буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА и 0,2% Тритон Х-100) при комнатной температуре в течение 10 мин. .Затем к лизату добавляли 100 мкл 5 М NaCl и смесь замораживали при -20 ° C в течение 40 мин. Замороженные лизаты размораживали при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученные супернатанты, содержащие вирусную ДНК, инкубировали со 100 мкг протеиназы K при 37 ° C в течение 1 часа. ДНК экстрагировали трис-забуференным фенолом дважды и один раз хлороформом, а затем осаждали этанолом. ДНК расщепляли различными рестрикционными ферментами, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, затем наносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt.

ДНК Hirt разделяли на нейтрально-щелочном двумерном геле (19). ДНК Hirt частично переваривали Hin dIII в течение 2 часов, а затем подвергали электрофорезу на агарозном геле первого измерения (0,4%) в буфере TAE (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ EDTA, pH 8,0) при 1,5 В / см для 20 ч. Дорожки ДНК обрабатывали на агарозном геле второго измерения (1,0% агароза в стерильной дистиллированной H ₂ O) в щелочном буфере для электрофореза (40 мМ NaOH, 2 мМ EDTA) при 1.5 В / см в течение 24 часов, а затем нанесли на нейлоновые мембраны. ДНК-блоты гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1, меченным ³² P.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Протопласты S. cerevisiae подвергались воздействию вирионов BPV-1, очищенных от бычьих папиллом, и различия в морфологическом внешнем виде протопластов S. cerevisiae наблюдались через несколько часов после воздействия вирионов, которые не наблюдались в неэкспонированных протопластах.В частности, наблюдалось, что многие клетки, подвергшиеся воздействию вирионов, были больше, чем необлученные клетки (рис.).

Морфологические наблюдения и Саузерн-блот-анализ инфицированной BPV-1 культуры S. cerevisiae . (A) Морфология протопластов S. cerevisiae после 2 дней культивирования без воздействия вируса BPV-1 и с ним. (B) Регенерация клеточной стенки протопластов S. cerevisiae с воздействием и без воздействия вирионов BPV-1 в различные моменты времени в культуре, как указано, продемонстрированная на нижних панелях путем окрашивания Calcofluor.На верхних панелях в каждом случае показана световая микроскопия одного и того же поля. (C) Просвечивающая электронная микрофотография ядерной секции S. cerevisiae , подвергшейся воздействию вируса BPV-1. NM указывает на ядерную мембрану. Барс, 200 нм. На вставке показано увеличение выделенной части (маленький квадрат) основного изображения, а полоса представляет собой 50 нм. (D) Саузерн-блот-анализ двух штаммов S. cerevisiae , подвергнутых, как показано, воздействию вируса BPV-1 за 48 часов до этого. S. cerevisiae (5 мл; 5 × 10 ⁷ клеток / мл) был инфицирован 0.2 мкг вируса BPV-1 и культивирование при осторожном встряхивании при 28 ° C в темноте. Через 24 часа добавляли 5 мл свежей среды. S. cerevisiae собирали для получения ДНК Hirt через 48 часов, и 10 мкг ДНК использовали для анализа саузерн-блоттингом. N – круг с надрезом; L, линейный; S, суперспиральная ДНК.

Calcofluor White (4,4′-бис [4-анилино-6-бис [2-гидроксиэтил] амино- s -триазин-2-иламино] -2,2′-стильбендисульфоновая кислота) использовался для исследования клеток. регенерация стен БПВ-1 экспонированная и неэкспонированная S.cerevisiae в культуре (фиг.), и инфицированные BPV-1 клетки S. cerevisiae были намного медленнее, чем неинфицированные клетки S. cerevisiae , регенерировали свою клеточную стенку. Основываясь на наблюдаемых морфологических изменениях, мы искали доказательства поглощения вируса BPV-1 клетками S. cerevisiae с помощью электронной микроскопии тонких срезов и наблюдали интактные вирионы в клетках S. cerevisiae (рис.). Мы также использовали иммунофлуоресцентную микроскопию инфицированного BPV-1 S.cerevisiae , чтобы продемонстрировать белок L1 BPV-1 в ядрах S. cerevisiae , и более 40% клеток S. cerevisiae показали значительное окрашивание L1 через 20 часов после заражения после воздействия вируса на S. cerevisiae с MOI 30: 1.

Для дальнейшего подтверждения поглощения вирионов BPV-1 протопластами S. cerevisiae мы приготовили ДНК супернатанта Hirt (ДНК Hirt) из двух линий S. cerevisiae (Y303 и M2915) до и после воздействия вирионов BPV-1. и исследовали ДНК Hirt на ДНК BPV-1 с помощью саузерн-блоттинга.ДНК-гибридизация с ДНК BPV-1 была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из обеих линий клеток S. cerevisiae после воздействия вируса BPV-1, но не в тех же линиях клеток до воздействия (рис.). Более того, ДНК BPV-1 не была обнаружена в ДНК Hirt, полученной из клеточных линий S. cerevisiae после воздействия эквивалентного количества вирусной ДНК, экстрагированной из вирионов BPV-1, что позволяет предположить, что голая эписомальная ДНК HPV не поглощается S .cerevisiae клеток.

Затем мы исследовали ДНК BPV-1 в образцах ДНК Hirt, приготовленных из одного S.cerevisiae , Y303, подвергался действию меньшего количества вирионов BPV-1 в различные моменты времени после заражения (рис.). Культуры, инфицированные BPV-1, разделяли каждые 24 часа, и одну треть использовали для получения ДНК Hirt, которую подвергали частичному перевариванию с помощью Hin dIII, которая должна разрезать ДНК BPV-1 в одном месте. Hirt ДНК из зараженных BPV-1 культур S. cerevisiae продемонстрировала специфическую гибридизацию с полосами, соответствующими разорванным кольцевым, линейным и суперспиральным мономерным ДНК BPV-1.Доля суперспиральной ДНК BPV-1 увеличивалась со временем в культуре, тогда как сигналы разорванного круга и линейных мономерных форм уменьшались за тот же период (рис.).

Чтобы определить, может ли геном BPV-1 сохраняться и реплицироваться по крайней мере так же часто, как геном S. cerevisiae в инфицированных BPV-1 S. cerevisiae в долгосрочной культуре, мы исследовали ДНК BPV-1 в БПВ-1-инфицированный S.cerevisiae культивировали в течение длительного периода. S. cerevisiae выращивали при 28 ° C в течение 5 дней и ежедневно субкультивировали, а затем выдерживали при 4 ° C в течение 15 дней. Субкультуру выращивали при 28 ° C и пассировали ежедневно в течение следующих 5 дней. Из этой субкультуры брали другую субкультуру, выдерживали при 4 ° C в течение 25 дней и пассировали ежедневно при 28 ° C в течение следующих 5 дней. Образцы, взятые в различные моменты времени, были использованы для приготовления ДНК Hirt, которая, как и ранее, была протестирована на геном BPV-1 (рис.).

Чтобы подтвердить репликацию ДНК в S. cerevisiae , мы проанализировали ДНК Hirt, полученную из инфицированных BPV-1 культур S. cerevisiae в нейтральных и щелочных двумерных гелях. Наблюдали типичный образец репликации ДНК BPV-1, включая виды размером 8 т.п.н. и 16 т.п.н. и один репликационный пузырь (рис.).

Двумерный гель-электрофорез ДНК Hirt из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур. Всего 10 мкг ДНК Hirt подвергали электрофорезу, как описано в тексте, наносили на нейлон и гибридизовали с ДНК-зондом BPV-1. На левой панели показаны результаты гибридизации блотов первого и второго измерений, а на правой панели показан схематичный образец промежуточных продуктов репликации.

Формат эпизомальной репликации ДНК BPV-1 в культурах

Чтобы охарактеризовать амплифицированную ДНК BPV-1, мы использовали различные комбинации ферментов для ограничения образцов ДНК Hirt, полученных из инфицированных BPV-1 S.cerevisiae культур (рис.). Неразрезанная ДНК из краткосрочных и долгосрочных культур показала специфическую гибридизацию с тремя полосами. Форма с надрезом в виде круга была намного сильнее, чем две другие формы во всех трех образцах ДНК Хирта. В ДНК Hirt, полученной из кратковременной зараженной BPV-1 культуры S. cerevisiae (5 дней), семь обработок ферментами рестрикции дали ожидаемые фрагменты ДНК BPV-1, когда блот зондировали с использованием гена L1 BPV-1 ( Рис. А). В Hirt ДНК, полученная из S.cerevisiae (55 дней), ферментные ограничения производили фрагменты, гибридизующиеся с ДНК BPV-1, аналогичные фрагментам из краткосрочной культуры. Также наблюдалась дискретная полоса в 1,5 т.п.н. (стрелка) неопределенного значения (рис. И). Эти результаты подтверждают, что ДНК BPV-1 в краткосрочных и долгосрочных культурах S. cerevisiae сохраняется в виде кольцевой эписомы.

Анализ рестрикционного фермента ДНК Hirt, полученной из инфицированных BPV-1 клеток S. cerevisiae в 5-дневной культуре (A) и 55-дневной культуре (B).Всего 10 мкг ДНК Hirt после расщепления ферментами в течение ночи, как показано, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле (верхние панели), наносили на нейлон и гибридизовали с геном L1 BPV-1, меченным ³² ( нижние панели). (C) Схема, показывающая сайты рестрикции семи ферментов для генома BPV-1 и расположение зонда L1.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что клеток S. cerevisiae могут поглощать вирионы BPV-1 и что вирусная эписома может реплицироваться в инфицированных BPV-1 S.cerevisiae клеток. Это открытие демонстрирует два неожиданных наблюдения: поглощение вируса папилломы клетками S. cerevisiae и репликация эписомы вируса папилломы в S. cerevisiae .

Поглощению папилломавирусов эпителиальными клетками помогают рецепторы на поверхности клетки, включая α ₆ -интегрин (5) и гликозаминогликаны (14). α ₆ -Интегрин необходим для поглощения HPV-6 некоторыми клетками in vitro (16), в то время как гепариноподобные гликозаминогликаны (синдеканы) необходимы для поглощения другими (8).Не известно, что протеогликаны S. cerevisiae включают синдеканы. Сапрофитные дрожжи, однако, экспрессируют интегриноподобные молекулы, которые позволяют клеткам прикрепляться к структурам клеточной поверхности (2), а S. cerevisiae также экспрессирует интегриноподобный белок на клеточной мембране (12). Таким образом, существует возможный механизм связывания вируса папилломы и его захвата протопластами S. cerevisiae с использованием идентифицированного вирусного рецепторного белка.

Мы решили провести наши эксперименты с использованием S.cerevisiae , чтобы максимизировать возможность демонстрации инфекции BPV-1, поскольку мы хотели изучить репликацию папилломавируса в пределах S. cerevisiae , а не процесс поглощения. Неизвестно, может ли связываться и поглощение папилломавируса интактным S. cerevisiae , хотя клеточная мембрана S. cerevisiae доступна для окружающей среды во время деления.

Поддержание стабильности за счет репликации внехромосомной ДНК в S.cerevisiae требует автономных репликационных последовательностей (ARS) (13, 23) и центромерных элементов (CEN) (6, 7). 10 из 11 нуклеотидов совпадают с согласованной основной последовательностью ARS (5 ‘- [A / T] TTTAT [A / G] TTT [A / T] -3’) в геноме BPV-1 (номер доступа J -02044) с нуклеотидами от 7097 до 7087. Другие AT-богатые последовательности могут обеспечивать аналогичную функцию (27), и существует более 50 AT-богатых 12-нуклеотидных последовательностей в геноме BPV-1, который сам относительно богат AT.

Как делящиеся, так и почкующиеся дрожжи могут реплицировать плазмиды, содержащие полный геном BPV-1 вместе с последовательностями ARS и CEN (22), независимо от того, введены ли они в виде круговой или линейной структуры.Кроме того, линеаризованный геном BPV-1 без последовательностей ARS и CEN, но украшенный (T2G4) _n «теломерными» повторами, поддерживался в том же исследовании, что и внехромосомная структура в клетках S. cerevisiae . Таким образом, наши исследования подтверждают это более раннее наблюдение, что геном BPV-1 может заменять ARS и CEN в S. cerevisiae и демонстрирует, что кольцевая эписомальная репликация генома BPV-1 может происходить в отсутствие экзогенных теломерных повторов.

В соответствии с нашими текущими наблюдениями, было замечено, что полноразмерный геном HPV16 при сцеплении в cis с выбираемым S.cerevisiae маркерный ген, либо trp , либо ura , может стабильно реплицироваться в виде эписомы в S. cerevisiae (1). В нашей системе стабильность вирусной плазмиды также была высокой в ​​отсутствие селектируемого маркера, при этом потеря вирусных плазмид не была обнаружена более чем в 13 случаях удвоения популяции.

Вирусы папилломы реплицируются в многослойных тканях плоского эпителия, в которых вирусный геном обнаружен в виде ядерной плазмиды. Вирусные элементы, необходимые для инициации репликации ДНК BPV-1, включают исходную область (20) и два trans -действующих фактора, белки E1 и E2 (21, 24).В настоящем исследовании мы не изучали специфические потребности в продуктах генов папилломавируса для репликации генома папилломавируса, хотя мы наблюдали экспрессию видов мРНК ранних и поздних генов и белка в инфицированных клетках S. cerevisiae (неопубликованные данные ). Анджелетти и др. (1) наблюдали, что геном HPV-16 может реплицироваться в S. cerevisiae без способности транскрибировать какие-либо из его открытых рамок считывания. Ген E2, экспрессируемый в trans , тем не менее увеличивал количество копий генома HPV-16.Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты для установления роли кодируемых вирусом белков, действующих в цис или транс в репликации эписомы BPV-1 в S. cerevisiae .

В заключение, наше исследование вместе с исследованием Angeletti et al. (1) предлагает дальнейшее понимание минимальных требований для репликации внехромосомной ДНК в S. cerevisiae и повышает вероятность того, что S. cerevisiae может действовать как разрешающий хозяин по крайней мере для некоторой части репликативного цикла папилломавируса.Предварительные данные (неопубликованные) предполагают, что белки BPV-1 эффективно экспрессируются в S. cerevisiae после заражения BPV-1, продуцируя вирионы, содержащие эписомальную ДНК BPV-1, и что выход вирионов по крайней мере эквивалентен входящему вирусу.

Благодарности

Эта работа была начата в сотрудничестве с покойным Цзянь Чжоу, который внес значительный вклад в разработку первоначальной экспериментальной работы. Мы благодарим Синь Цзе Чена и Вэнь Цзюнь Лю за полезные обсуждения.

Эта работа частично финансировалась Фондом рака Квинсленда, Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии и Фондом больницы принцессы Александры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Вирус папилломы крупного рогатого скота типа 1 (BPV1) и BPV2 являются близкородственными серотипами

VLP BPV1 и BPV2 частично имеют общие эпитопы нейтрализации

VLP BPV1 были созданы путем экспрессии L1 в клетках насекомых и очищены в градиентах плотности как описанный ранее (Kirnbauer et al., 1992). Для создания VLP BPV2 открытая рамка считывания (ORF) L1 была амплифицирована из геномной ДНК BPV2 аналогичным образом, клонирована в вектор экспрессии бакуловируса pEVmod и подтверждена секвенированием. После генерации рекомбинантных бакуловирусов L1 BPV2 экспрессировали в клетках насекомых Sf-9 и подтверждали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси, а также вестерн-блоттинга с использованием ненейтрализующего моноклонального антитела (mAb) AU-1 (индуцированного против BPV1). AU-1 распознает линейный эпитоп BPV1-L1 DTYRYI, который, как предполагается, также существует в BPV2-L1.Как и ожидалось из-за их близкой гомологии, очищенные белки BPV1 и BPV2-L1 мигрировали так же, как белки 55 кДа на окрашенном Кумасси геле (дорожки 4 и 6). Вестерн-блоттинг продемонстрировал основную иммунореактивную полосу 55 кДа в клеточных лизатах и ​​очищенном препарате VLP для обоих типов BPV (дорожки 3-6), как и предполагалось, но не в контрольных лизатах неинфицированных или инфицированных бакуловирусом дикого типа клеток Sf-9 ( , дорожки 1 и 2). Меньшие полосы, вероятно, представляют деградированные белки, как это наблюдается для сверхэкспрессированных белков L1 различных типов папилломавирусов.Очищенные препараты BPV1 и BPV2 дополнительно исследовали с помощью отрицательного окрашивания и просвечивающей электронной микроскопии (TEM), демонстрируя самосборку в VLP диаметром около 60 нм и морфологию, аналогичную другим типам вирусов папилломы ().

L1 BPV1 и BPV2 были экспрессированы рекомбинантными бакуловирусами, а VLP были очищены центрифугированием в градиенте плотности. Неочищенные клеточные лизаты и очищенные VLP разделяли с помощью SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси (а) или вестерн-блоттингом (b) с использованием mAb AU-1, индуцированного против L1 BPV1 (при разведении 1/10 000).Оба белка L1 мигрировали как белки массой 55 кДа. Более быстро мигрирующие иммунореактивные полосы, вероятно, представляют продукты деградации. Указаны маркеры молекулярной массы (MW). Неинфицированные (Sf-9) клетки или клетки, инфицированные бакуловирусом дикого типа, служили контролем. Для просвечивающей электронной микроскопии (TEM) (c) очищенные VLP были отрицательно окрашены 1% уранилацетатом и визуализированы при увеличении × 30 000. Масштабная шкала представляет 200 нм.

Основные эпитопы нейтрализации папилломавирусов зависят от конформации и расположены на поверхностных петлях собранных капсидов или пентамеров L1.Чтобы проверить, имеют ли VLP BPV1 и BPV2 общие перекрестно-реактивные эпитопы, ELISA выполняли в неденатурирующих (нативных) условиях (). Сыворотки кроликов, вакцинированных L1 VLP либо BPV1, либо BPV2, анализировали на их способность реагировать на гомологичные и гетерологичные типы. Кроме того, VLP зондировали с помощью mAb на конформационно-зависимые эпитопы BPV1. Частицы диспергировали в лунках и инкубировали в трех экземплярах с 10-кратными серийными разведениями антител в диапазоне от 10 ^-2 до 10 ^-5 ().Обе антисыворотки распознавали VLP BPV1 и BPV2 с помощью ELISA с титром 10 000, что, как и ожидалось, указывает на то, что у кроликов могут генерироваться антитела, перекрестно реагирующие с соответствующим гетерологичным типом. Однако вполне вероятно, что по крайней мере часть наблюдаемой перекрестной реактивности может быть отнесена к линейным ненейтрализующим эпитопам, которые экспонируются на частично разобранных VLP или денатурированном белке. Это согласуется с реактивностью обоих типов BPV по отношению к AU-1, который распознает линейный эпитоп L1 (,) (Ghim, Young, and Jenson, 1996).MAb B1.C4, B1.D7 и B1.F12 были повышены до VLP BPV1 и mAb B1. A1 и 5B6 были повышены до вирионов BPV1. Как показано на, наблюдались два типа паттерна связывания антител. MAb B1.C4 и B1.D7 распознают VLP как BPV1, так и BPV2-L1, при этом B1.D7 менее реагирует на BPV2 по сравнению с BPV1. Напротив, реактивность 5B6, B1.F12 и B1.A1 была ограничена VLP BPV1. Эти результаты показали, что VLP BPV1 и BPV2 имеют общие конформационно-зависимые эпитопы, которые обнаруживаются некоторыми mAb на обоих VLP.Кроме того, существуют другие эпитопы, которые являются типоспецифичными, о чем свидетельствует реактивность mAb, ограниченная BPV1.

VLP BPV1 (a) или BPV2 VLP (b) анализировали в неденатурирующих (нативных) условиях с использованием антисыворотки, индуцированной к VLP BPV1-L1 и BPV2-L1, и mAb, направленным на конформационные эпитопы BPV1. VLP инкубировали с 10-кратными серийными разведениями (от 10 ^-2 до 10 ^-5 ) антител.Данные выражены как среднее значение ОП ± стандартное отклонение для трех лунок. Способность антител к нейтрализации при конечном разведении 1: 100 определяли с помощью анализов нейтрализации с образованием очага C127 с использованием нативных вирионов BPV1 (a) или BPV2 (b). +, Нейтрализующий, -, не нейтрализующий; н.о., не определено.

Анализы нейтрализации вирионов BPV1 / BPV2 и псевдовирионов BPV1

Эффективность вакцин против папилломавируса коррелирует с их способностью индуцировать нейтрализующие сывороточные антитела, которых достаточно для защиты от экспериментальной инфекции (Breitburd et al., 1995; Сузич и др., 1995). Таким образом, мы затем определили, нейтрализуют ли антисыворотки, индуцированные вакцинацией VLP, против соответствующих гомологичных и гетерологичных типов. Инфекционные вирионы BPV1 или BPV2 инкубировали с антисывороткой против гомологичного или гетерологичного типа VLP в течение 1 часа перед инфицированием фибробластов мыши C127. После 3 недель поддержания культуры окрашивали для выявления фокально трансформированных клеток, указывающих на успешные инфекционные события (Dvoretzky et al., 1980). Как показано на фиг.4, бесчисленные очаги развивались в культурах, инфицированных вирионами BPV1, инкубированных с преиммунной сывороткой.Напротив, сыворотка против BPV1 нейтрализована с титром 1000, тогда как антисыворотка против BPV2 нейтрализована с титром 100 (≥ 50% уменьшение количества очагов, полученных с преиммунной сывороткой). Аналогичным образом, при анализе на нейтрализацию BPV2 () сыворотки как против BPV1, так и против BPV2 нейтрализованы с титром 1000 (показан один представитель по меньшей мере 3 независимых экспериментов для обоих типов). Как показано ранее, антисыворотки, полученные против денатурированных VLP или гетерологичных VLP HPV16, не нейтрализуют вирионы BPV1 (Kirnbauer et al., 1992; Роден и др., 1996). Мы также использовали псевдовирионы BPV1 (Buck et al., 2005) для тестирования кроличьей антисыворотки к VLP BPV2 и BPV1-L1 на способность к нейтрализации. Антисыворотка к VLP BPV1 и BPV2 (перекрестная) нейтрализовала псевдовирионы BPV1 с титром 1000 и 100, соответственно, тогда как антисыворотка против VLP HPV16, использованная в качестве контроля, не была нейтрализующей (не показано).

Инфекционные вирионы BPV1 (a) или BPV2 (b), очищенные от коровьих бородавок, предварительно инкубировали с иммунными сыворотками, высевали на фибробласты C127, выдерживали в течение 3 недель при регулярном кормлении и окрашивали.Контрольные планшеты не содержали вируса (только клетки) или инкубировали вирус с преиммунной сывороткой при разведении 10 ^-2 . Антисыворотки, полученные против VLP BPV1 или BPV2-L1, серийно разводили в 10 раз от 10 ^-2 до 10 ^-5 , как указано. Титры нейтрализации оцениваются визуально как величина, обратная наибольшему разведению сыворотки, что приводит к ≥50% снижению количества очагов, полученных с преиммунной сывороткой.

Эти результаты показывают, что VLP как BPV1, так и BPV2 могут индуцировать нейтрализующие антисыворотки к их гомологичному типу, а также перекрестную нейтрализацию до гетерологичного типа.Учитывая, что нейтрализующая активность как антисывороток к BPV1 VLP, так и BPV2 VLP не более чем на один порядок меньше против гетерологичного вируса по сравнению с таковой против гомологичного вируса, это ясно указывает на то, что BPV1 и BPV2 являются близкородственными серотипами. Следствием этих результатов является то, что моновалентная вакцина, состоящая из VLP из BPV1 или BPV2, вероятно, будет обеспечивать такую ​​же степень защиты от гетерологичного вируса, как и от гомологичного вируса.

Затем мы определили относительную способность mAb к BPV1 нейтрализовать инфекционные BPV1 и BPV2.Нативные вирионы экстрагировали из двух разных коровьих бородавок и генотипировали вирусные ДНК с помощью L1-секвенирования. Результаты показали присутствие BPV1 или BPV2, соответственно, с такой же степенью нуклеотидного родства, как и в GenBank (не показано). Как показали анализы фокусообразующей нейтрализации, mAb 5B6, B1.C4, B1.F12 и B1.A1 (разведение 1: 100) нейтрализовали вирионы BPV1, тогда как B1.D7 не нейтрализовал (). Напротив, ни одно из mAb не было способно нейтрализовать BPV2 (не тестировалось на B1.F12), независимо от того, были ли они реактивны на BPV2 VLP с помощью ELISA ().Типоспецифичность моноклональных антител по сравнению с поликлональными антителами отражает различия в разнообразии эпитопов, распознаваемых этими двумя реагентами. Моноклональные антитела распознают один эпитоп, и изменение одной аминокислоты в этом эпитопе может устранить это связывание (как мы показали в случае связывания mAb h26.E70 с L1 HPV16 одного варианта, но не с другим (Roden et al., 1997). )). Примечательно, что основные иммунодоминантные нейтрализующие эпитопы L1 содержат подавляющее большинство аминокислотных замен между вариантами и типами.Напротив, поликлональные антитела распознают множество эпитопов, поэтому маловероятно, что одно изменение в одном эпитопе существенно повлияет на его реактивность (что согласуется с перекрестной нейтрализацией всех вариантов HPV16, протестированных антисывороткой, к одному VLP L1 варианта HPV16 (Cheng et al. др., 1995)). Мы также предполагаем другие менее вероятные объяснения, включая предвзятость иммунизации мышей в сторону генерации типоспецифичного, а не перекрестно нейтрализующего иммунного ответа, или предвзятость отбора для гибридом с использованием капсидов BPV1.Удивительно, но B1.C4, который связывал и VLP, и типы вирионов с помощью ELISA () или FACS (не показан), оказался нейтрализующим только к вирионам BPV1, но не к BPV2, что указывает на небольшое различие в последовательности, структуре или функции эпитопов между типами. .

По аналогии с результатами вакцинации VLP у людей и экспериментальной вакцинации коров, вероятно, что вакцина VLP защитит коров как от эпидермальных, так и от кожных инфекций (Campo, 1997; Kirnbauer et al., 1996; Paavonen et al. al., 2007; Villa et al., 2005). Однако неизвестно, будет ли он защищать от кожной инфекции у лошадей и, таким образом, быть таким же эффективным в защите от саркоидов, поскольку кажется возможным, что детали патогенеза кожной инфекции у коров и лошадей могут отличаться, что может иметь последствия. для эффективности вакцины. У коров большинство кожных инфекций может происходить от потомства вируса, который реплицировался в вышележащем эпидермисе. Вакцины VLP могут быть высокоэффективными отчасти потому, что они препятствуют способности потомства вируса распространяться к вторичным очагам инфекции.У лошадей, напротив, нет вирусов-потомков, которые, как известно, развиваются в эпидермисе или дерме. Следовательно, вполне вероятно, что кожная инфекция у лошадей возникает de novo из-за внешних вирионов. Хотя эти поступающие вирионы будут нейтрализованы системными антителами, это предположение еще предстоит доказать. В настоящее время мы проводим испытания вакцинации против BPV1 VLP для оценки эффективности против экспериментального заражения лошадей.

Исследования вакцины VLP для человека показали стабилизацию титров вакцины и высокую защитную эффективность по крайней мере через 6 лет после вакцинации.По аналогии, это находится в пределах временного диапазона лактации у коров, требующих эффективной защиты. Еще предстоит определить потенциал долгосрочной эффективности вакцины для лошадей, мулов и ослов, которая может сохраняться до нескольких десятилетий.

N-конец L2 содержит широкие эпитопы перекрестной нейтрализации, которые являются общими для кожного и слизистого типов. Вакцинация минорным капсидным белком L2 индуцировала антитела с низким титром и защищала крупный рогатый скот и кроликов от заражения гомологичным типом вируса как на кожных, так и на слизистых участках (Campo, 1997; Embers et al.