Универсальный внешний накопитель для всех iOS-устройств, совместим с PC/Mac, Android
Header Banner
8 800 100 5771 | +7 495 540 4266
c 9:00 до 24:00 пн-пт | c 10:00 до 18:00 сб

Ч3 54: Ч3-54 Частотомер

0 Comments

Содержание

Ч3-54 частотомер электронно-счетный, доставка из Королёва

Частотомер Ч3-54 относится к одним из самых надёжных, проверенных измерительных приборов отечественного производства. Несмотря на обилие современных электронных частотомеров, многие специалисты и любители отдают предпочтение именно Ч3-54. Это устройство занимает почётное место во многих лабораториях.

Частота – это параметр, которым обладают периодические и пульсирующие токи. Она показывает, сколько периодических колебаний было совершено в течение полного цикла. Измерение этого параметра часто требуется при научных исследованиях, в промышленности, при работе с радиоаппаратурой, телекоммуникационными и другими электронными устройствами.

Основные технические характеристики:

Диапазон частот

Погреш-ность по частоте кварцевого генератора за 1 месяц

Уровень входного сигнала

Пределы измерения длительности

Диапазон при измерении отношения частот

Частота выдаваемого сигнала

синусои-дальных сигналов

AM, ИМ сигналов

0,1 Гц-300 МГц

1,5*10-7

0,1 – 100 В (0,1 Гц – 120 МГц), 0,2-3 В (120-300 МГц)

0-1 МГц

10-7-10-5 с

10 Гц – 150 МГц
0 – 1 МГц

0,1; 1; 10; 100 Гц; 1; 10; 1; 5; 10 и 50 МГц

Для измерения частоты идеально подходит частотомер Ч3-54. Кроме того, используя этот прибор, можно узнать частотные разность и отношение, период, число импульсов, произведённых за конкретный отрезок времени, частоту вращения. Он позволит проанализировать поведение отдельных сигналов в сложном спектре, выводя полученные данные в наглядном виде, удобном для восприятия человеком. Использование этого прибора сильно сэкономит время на сравнение исследуемых параметров между собой. Возможная погрешность при измерении невелика.

Полученные показания частотомер выводит на монитор с подсветкой красного цвета, способный отображать 8-разрядные числа. Также прибор имеет выход с возможностью цифровой печати. Имеется кнопка для запуска прибора или сброса показаний вручную. То же самое можно проделать с помощью соответствующего входа. Частотомер Ч3-54 оснащён набором индикационных элементов – газоразрядных индикаторов, неоновых ламп, лампы, сигнализирующей о состоянии термостатного нагревателя, светодиодов и ртутного счётчика наработки (в некоторых модификациях).

Включать прибор следует за час до планируемых измерений – это время необходимо частотомеру на прогрев. Будьте осторожны с нагревающимися и ртутьсодержащими элементами частотомера Ч3-54.

Купить частотомер Ч3-54 с доставкой вы можете в нашей компании!

Покупаем на выгодных условиях: платы, радиодетали, микросхемы, АТС, приборы, лом электроники, катализаторы

Мы гарантируем Вам честные цены! Серьезный подход и добропорядочность – наше главное кредо.

Компания ООО «РадиоСкупка» (скупка радиодеталей) закупает и продает радиодетали , а также любое радиотехническое оборудование и приборы. У нас Вы сможете найти не только наиболее востребованные радиодетали, но и редкие производства СССР и стран СЭВ. Мы являемся партнером  «ФГУП НИИ Радиотехники» и накопили огромный опыт  за наши годы работы. Также многих радиолюбителей заинтересует наш уникальный справочник по содержанию драгметаллов в радиодеталях. В левом нижнем углу нашего сайта Вы сможете узнать актуальные цены на драгметаллы такие, как золото, серебро, платина, палладий (цены указаны в $ за унцию) а также текущие курсы основных валют. Работаем со всеми  городами России и география нашей работы простирается от Пскова и до Владивостока. Наш квалифицированный персонал произведет грамотную и выгодную для Вас оценку вашего оборудования, даст профессиональную консультацию любым удобным Вам способом – по почте или телефону.  Наш клиент всегда доволен!

Покупаем платы, радиодетали, приборы, АТС, катализаторы. Заинтересованы в выкупе складов с неликвидными остатками радиодеталей а также цехов под ликвидацию с оборудованием КИПиА.

Приобретаем:

  • платы от приборов, компьютеров
  • платы от телевизионной и бытовой техники
  • микросхемы любые
  • транзисторы
  • конденсаторы
  • разъёмы
  • реле
  • переключатели
  • катализаторы автомобильные и промышленные
  • приборы (самописцы, осциллографы, генераторы, измерители и др.)

Купим Ваши радиодетали и приборы в любом состоянии, а не только новые. Цены на сайте указаны на новые детали. Расчет стоимости б/у деталей осуществляется индивидуально в зависимости от года выпуска, состоянии, а также текущих цен Лондонской биржи металлов. Работаем почтой России, а также транспортными компаниями. Наша курьерская служба встретит и заберет Ваш груз с попутного автобуса или поезда.

Честные цены, наличный и безналичный расчет, порядочность и клиентоориентированность наше главное преимущество!

Остались вопросы – звоните 8-961-629-5257, наши менеджеры с удовольствием ответят на все Ваши вопросы. Для вопросов по посылкам: 8-900-491-6775. Почта [email protected]

С уважением, директор Александр Михайлов.

Частотомер Ч3-54

Справочник количества содержания ценных металлов в Частотомер Ч3-54 согласно паспортов формуляров и сборной информационной литературы. Указано точное значение драгоценных металлов в граммах (Золото, серебро, платина, палладий и другие) на единицу изделия.

Содержание драгоценных металлов в Частотомер Ч3-54

Золото: 7,79 грамм.
Серебро: 24,515 грамм.
Платина: 0 грамм.
Палладий: 0,66 грамм.

Источник информации: .

Фото Ч3-54:

Частотомер – измерительный прибор


Частотомер – прибор для измерения частоты периодических процессов (колебаний). Частоту механических колебаний обычно измеряют с помощью вибрационных механических Ч. и электрических Ч., используемых совместно с преобразователями механических колебаний в электрические. Простейший вибрационный механический Ч., действие которого основано на Резонансе, представляет собой ряд упругих пластин, укрепленных одним концом на общем основании. Пластины подбирают по длине и массе так, чтобы частоты их собственных колебаний составили некую дискретную шкалу, по которой и определяют значение измеряемой частоты. Механические колебания, воздействующие на основание Ч.

, вызывают вибрацию упругих пластин, при этом наибольшая амплитуда колебаний наблюдается у той пластины, у которой частота собственных колебаний равна (или близка по значению) измеряемой частоте.

Частотоме́р (неправ. частотометр) — измерительный прибор для определения частоты периодического процесса или частот гармонических составляющих спектра сигнала.

Наименования и обозначения

Устаревшие наименования
Волномер — для резонансных и гетеродинных частотомеров
Герцметр — для щитовых аналоговых и язычковых частотомеров
Для обозначения типов электроизмерительных (низкочастотных) частотомеров традиционно используется отраслевая система обозначений, в которой приборы маркируются в зависимости от системы (основного принципа действия)

Вхх — вибрационные частотомеры
Дхх — приборы электродинамической системы
Эхх — приборы электромагнитной системы
Мхх — приборы магнитоэлектрической системы
Цхх — приборы выпрямительной системы
Фхх, Щхх — приборы электронной системы
Нхх — самопишущие приборы

Частотомеры радиодиапазона маркируются по ГОСТ 15094
Ч2-хх — резонансные частотомеры
Ч3-хх, РЧ3-хх — Электронно-счетные частотомеры
Ч4-хх — гетеродинные, конденсаторные и мостовые частотомеры

Частотомер – видео.

Характеристики Ч3-54:

Купить или продать а также цены на Частотомер Ч3-54:

Оставьте отзыв о Ч3-54:

Купим частотомер – Радиолом77

Ч3-20

Электронно-счетный частотомер

  

Ч3-22

Частотомер-периодомер

  

Ч3-24

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-28

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-30

Частотомер электронно-счетный

 

  

Ч3-32

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-33

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-34(А)

Частотомер электронно-счетный

    

Ч3-35

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-36

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-38

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-44

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-45

Ч3-46

Частотомеры электронно-счетные

  

Ч3-47

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-49

Частотомер электронно-счетный

    

Ч3-54

Частотомер электронно-счетный

    

Ч3-57

Частотомер электронно-счетный

    

Ч3-58

Частотомер электронно-счетный автоматический

  

Ч3-60

Ч3-62

Частотомеры электронно-счетные

  

Ч3-63

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-63/1

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-64

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-64/1

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-65

Частотомер электронно-счетный

  

Ч3-66

Частотомер электронно-счетный

  

Ч6-2

Умножитель частоты

  

 

Список приборов предоставленный на нашем сайте не полный. Если Вы нашли прибор который отсутствует на сайте и в прайс листе и если Вы хотите его продать, свяжитесь с нами любым из возможных способов в контактах и уточните его стоимость.

D2U5T-h4-7000-54-HU4C | Закрытый входной 3-фазный | Преобразователи переменного тока в постоянный | Электропитание | Murata Manufacturing Co., Ltd.

Для приложений, не требующих особой надежности, например, общего оборудования
Информационно-развлекательная система для автомобилей
Продукт для развлекательного оборудования, такого как автомобильная навигация, автомобильные аудиосистемы, а также оборудование для управления кузовом, такое как дворники, электрические стеклоподъемники.
Трансмиссия / Безопасность для автомобилей
Продукт, используемый для приложений (запуск, поворот, остановка и устройства безопасности), которые особенно касаются жизни человека, например, в устройствах для автомобилей.
Где Murata рекомендует компоненты автомобильного класса
Продукты медицинского назначения для имплантированных медицинских устройств
Эти продукты предназначены для использования в имплантированных медицинских устройствах, таких как кардиостимуляторы, кохлеарные имплантаты, инсулиновые помпы и электростимуляторы желудка.
Они подходят для использования в некритических цепях. * 1

* 1 Некритические цепи
Этот термин относится к цепям в имплантированных медицинских устройствах, которые напрямую не связаны с жизнеобеспечением, т.е.е. цепи, которые не будут напрямую угрожать жизни пациента, если функциональность устройства будет снижена или остановлена ​​из-за отказа цепи.

Может использоваться до 150 ℃ макс.
* Есть значки множественного числа температуры.
Продукт, соответствующий директиве RoHS

Этот продукт не содержит веществ с ограничениями, указанных в Директиве RoHS, с более чем максимальным значением концентрации по весу в однородном материале, за исключением случаев, подпадающих под исключения RoHS.

Запрещенные вещества Максимальное значение концентрации
Свинец 0,1%
Меркурий 0,1%
Кадмий 0,01%
Шестивалентный хром 0.1%
Полибромированные дифенилы (ПБД) 0,1%
Полибромированные дифениловые эфиры (ПБДЭ) 0,1%
Бис (2-этилгексил) фталат (ДЭГФ) 0,1%
Бутилбензилфталат (BBP) 0,1%
Дибутилфталат (DBP) 0. 1%
Диизобутилфталат (ДИБФ) 0,1%
Регламент REACH совместимый продукт:
Продукт соответствует положениям ПОСТАНОВЛЕНИЕ (ЕС) № 1907/2006 (Достигать).

Ограничение веществ, содержащихся в статье, в соответствии с Reach:
Регламент REACH налагает ограничения на применение продуктов и запрет веществ на основании статьи 67.1.
Включение Вещество, вызывающее очень большую озабоченность (SVHC) в Списке кандидатов, создает обязанность сообщать информацию о веществах в изделиях, чтобы обеспечить безопасное использование изделия, что применимо к поставщикам в Европе (статья 33). Оно делает не налагает никаких ограничений на использование продуктов и не является запретом на вещества. пожалуйста, проверьте «Продукты Murata, содержащие SVHC и информацию о безопасном использовании» .

Продукт, соответствующий стандарту AEC-Q200
Продукты, получившие сертификат безопасности IEC60384-14.
Сертификат стандарта безопасности
Продукты, соответствующие японскому закону о безопасности электроприборов и материалов.
Изделие на номинальное напряжение от 10 до 40 кВ
Низкое рассеивание для высоких частот
Благодаря разработке керамических материалов и электродных материалов низкое рассеивание достигается в полосах частот VHF, UHF и микроволнового диапазона или выше.
Низкая индуктивность
Конденсатор разработан таким образом, что паразитная составляющая индуктивности (ESL) конденсатора на высокочастотной стороне становится меньше.
Продукт подходит для снижения акустического шума и низкого уровня искажений.
Этот продукт подавляет акустический шум, который возникает при использовании керамического конденсатора, путем разработки материалов и конфигурации.
Изделие, устойчивое к растрескиванию при прогибе.
Этот конденсатор разработан для максимального предотвращения отказов из-за короткого замыкания, вызванного растрескиванием при прогибе платы.
Изделие с защитой от растрескивания припоя
“Этот конденсатор снабжен металлическими клеммами и выводами, подключенными к микросхеме. Металлические клеммы и выводы снимают напряжение от расширения и сжатия припоя, чтобы предотвратить растрескивание припоя ».
Нет характеристик смещения постоянного тока.
Полимерный конденсатор не имеет изменения емкости при смещении постоянного тока из-за оксидированной алюминиевой пленки для диэлектрика.
Полностью используя водоотталкивающие свойства поверхностей конденсатора, этот продукт сводит к минимуму миграцию ионов от внешних электродов (выводов), которая возникает в результате конденсации.
Изделие с низкой индуктивностью, предназначенное для подавления шума.
Этот продукт имеет чрезвычайно низкий ESL и подходит для подавления шума, в том числе высоких частот.
Способствует подавлению шума в качестве фильтра электромагнитных помех.
Изделие для пайки оплавлением
Изделие для пайки проточной водой
Ограничивается монтажом на токопроводящем клее
Поскольку для внешних электродов используется палладий из серебра, конденсатор можно закрепить с помощью токопроводящего клея.
Изделие для склеивания
Поскольку для внешних электродов используется золото, конденсатор может быть установлен путем соединения кристаллов / проводов.
Изделие для сварки
Конденсатор со свинцовыми электродами и может быть установлен сваркой. Пожалуйста, свяжитесь с нами по поводу материала свинцового провода.
Изделие для винтового крепления

ML1H-h454 Барксдейл | ML1H Локальный переключатель температуры

Свяжитесь с нашими экспертами по фильтрации

Свяжитесь с нашими специалистами по фильтрации, чтобы ответить на вопросы или помочь вам с любыми требованиями.

Услуги по фильтрации:

  • Консультации по фильтрации
  • Аудит
  • Инжиниринг и дизайн
  • Обучение и поддержка на месте

Свяжитесь с нашими экспертами по калибрам

Нужна помощь в выборе манометра? Свяжитесь с нашими специалистами, чтобы ответить на вопросы.

Воспользуйтесь нашим инструментом Gauge Finder Tool для поиска по определенным атрибутам в соответствии с потребностями вашего приложения.

Услуги

  • Услуги по калибровке манометров
  • Сборка и установка манометрического уплотнения
  • Монтаж и обслуживание разделительной диафрагмы
  • Наполнение манометра различными типами заливок
  • Диапазоны измерения давления с настраиваемой шкалой
  • Контрольные проверки для обеспечения надлежащего функционирования
  • Калибровка и ремонт вакуумметра

Свяжитесь с нашими экспертами в области управления движением и автоматизации

Свяжитесь с нашими экспертами, чтобы ответить на вопросы или помочь вам с вашим приложением.

Услуги

  • Управление и автоматизация
  • Службы панели управления
  • Проектирование системы управления
  • Службы машинного зрения
  • Контракты на техническое обслуживание / ремонт
  • Услуги ПЛК
  • Ремонтный центр Rexroth Indramat

Свяжитесь с нашими экспертами по контролю процессов

Свяжитесь с нашими экспертами, чтобы ответить на вопросы или помочь вам с вашим приложением.

Услуги

  • Услуги по распределению компонентов
  • Управление запасами на месте
  • Услуги автоматизации производства
  • Товарная экспедиторская
  • Уведомление об устаревании продукта и его замена
  • Комплектация и упаковка
  • Пользовательская маркировка

Свяжитесь с нашими специалистами по технологическому теплу

Свяжитесь с нашими экспертами, чтобы ответить на вопросы или помочь вам с вашим приложением.

Услуги

  • Расчет теплопотерь
  • Расчет тепловых потерь
  • Запуск технологического нагревателя и панели управления
  • Пусконаладочные работы и запуск тепловой системы
  • Поддержка на месте

Свяжитесь с нашими специалистами по работе с жидкостями

Свяжитесь с нашими экспертами, чтобы ответить на вопросы или помочь вам с вашим приложением.

Услуги

  • Расчет теплопотерь
  • Расчет тепловых потерь
  • Запуск технологического нагревателя и панели управления
  • Пусконаладочные работы и запуск тепловой системы
  • Поддержка на месте

Изготовленные на заказ изделия из натурального дерева, произведенные в США, в различных стилях, размерах, вариантах и ​​цветах.

  • Стандартные шкафы Aristokraft
  • Полу-нестандартные шкафы, книжные шкафы и развлекательные компоненты от Woodcraft или Arthur Brown и
  • Настраиваемые шкафы и книжные шкафы Canyon Creek с множеством опций и тысячами нестандартных цветов окраски

Книжные шкафы, кухонные шкафы, развлекательные центры, системы хранения и многое другое


Настройте свой дом или офис по супер доступной цене!

Чтобы сделать онлайн-заказ сейчас, нажмите на быстрые ссылки ниже.

Большинство продуктов можно настроить в соответствии с вашими требованиями к размеру, они доступны по сниженным онлайн-ценам и доставляются непосредственно вам через транспортную компанию. Все изделия Woodcraft и Arthur Brown доступны в незавершенном виде или без отделки с различными морилками, красками или специальными покрытиями!

Чтобы получить еще больший выбор стилей дверей, пород дерева, вариантов шкафа и вариантов индивидуальной настройки, спросите о нашей индивидуальной мебели Canyon Creek и новой программе дизайнерских услуг.

Кухонные шкафы на заказ Книжные шкафы на заказ Мебель на заказ
Стандартные базовые шкафы
Шкафы с несколькими выдвижными ящиками
Специальные шкафы
Угловые шкафы
Раковины и кухонные шкафы
Высокие базовые шкафы
Настенные шкафы H 12-15 дюймов
Настенные шкафы 18 дюймов
Настенные шкафы 24 дюйма H
30 Навесные шкафы H
Навесные шкафы 36 дюймов H
Настенные шкафы 42 дюйма H
Специальные навесные шкафы		 Наполнители и выдвижные шкафы
Мебельный стиль
Кухонные аксессуары
Торцевые панели шкафа
Валенсия
Системы контейнеров для мусора
Тумбы для умывальника
Двери на заказ		 Книжные шкафы Arthur Brown
(Face Frame, Federal,
Crown, Shaker, Regal,
& Hampton)

Книжные шкафы Woodcraft:
Аксессуары
Budget Birch
Contemporary
Contemporary Corner
Cottage
Рифленая
Shaker
Traditional
Традиционный уголок
Винтаж

 Arthur Brown Entertainment
Офис Arthur Brown
Arthur Brown Storage
Arthur Brown Bars
(Face Frame, Federal,
Crown, Shaker, Regal,
и Hampton)
Woodcraft Entertainment:
Коттедж
Рифленый
Хэмпшир
Шейкер
Традиционный
 Woodcraft Office:
Cottage
Country
Рифленый
Шейкер
Традиционный
Vintage
Woodcraft Спальня:
Cottage
Рифленый
Hampshire
Shaker
Vintage
Woodcraft Living & Dining:
Скамейки
Cottage
Country
Shaker
Традиционный

Кухонные шкафы и книжные шкафы поставляются в полностью собранном виде, их можно заказать с нестандартной шириной, высотой и глубиной, а также их можно использовать для создания индивидуального домашнего офиса. Соединяйте части вместе, чтобы создать встроенные книжные полки, стенки и развлекательные центры. См. Подробные сведения о вариантах шкафов и на страницах с вариантами книжных шкафов. Обновите существующие шкафы с нашими дверцами для шкафов на заказ.

Для начала , щелкните ссылку продукта слева, а затем щелкните элемент, размер которого равен или больше желаемого. При нажатии на товар вы увидите все варианты и цены, а также сможете сделать заказ онлайн.Для получения дополнительной информации перейдите на страницу «Как сделать заказ». Если вы не видите вариант, который вам нужен, просто напишите нам по электронной почте или отправьте рисунок по факсу на номер 480-287-9966, и мы сообщим вам, что мы можем сделать. Чтобы снизить накладные расходы и цены, у нас нет дежурного человека, который мог бы ответить на звонок. Итак, если вам нужно с кем-то поговорить, отправьте нам электронное письмо со своим номером телефона, и мы вам перезвоним.

Политика конфиденциальности: Highlands Designs, LLC обрабатывает всю личную информацию конфиденциально в соответствии с высочайшими этическими стандартами. Мы не будем передавать ваши личные данные или информацию кому-либо без вашего предварительного разрешения, и мы регулярно удаляем всю финансовую информацию из нашей базы данных.

Пан-метил-гистон h4 (Lys9) (D54) XP® Rabbit mAb

Хроматин IP

Специально для продукта: SimpleChIP ® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Магнитные шарики) # 9005.

Необходимые реагенты

Реагенты в комплекте:

  1. Раствор глицина (10X) # 7005
  2. Буфер A (4X) # 7006
  3. Буфер B (4X) # 7007
  4. Чип-буфер (10X) # 7008
  5. Буфер для элюции ChIP (2X) # 7009
  6. 5 M NaCl # 7010
  7. 0.5 M ЭДТА # 7011
  8. Магнитные шарики с протеином G класса ChIP # 9006
  9. Буфер для связывания ДНК №10007
  10. Буфер для промывки ДНК (перед использованием добавьте 4-кратный объем этанола) # 10008
  11. Буфер для элюции ДНК №10009
  12. Колонки для очистки ДНК и пробирки для сбора # 10010
  13. Коктейль с ингибиторами протеазы (200X) # 7012
  14. РНКаза А (10 мг / мл) # 7013
  15. Нуклеаза микрококка №10011
  16. Протеиназа К (20 мг / мл) # 10012
  17. SimpleChIP ® Праймеры экзона 3 RPL30 человека 1 # 7014
  18. SimpleChIP ® Mouse RPL30 Интрон 2 Праймеры 1 # 7015
  19. Гистон h4 (D2B12) XP ® Кролик mAb (в составе ChIP) # 4620
  20. Нормальный IgG кролика # 2729
  21. DTT (дитиотреитол) # 7016

Реагенты, не включенные:

  1. Стойка для магнитной сепарации # 7017/14654
  2. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS-1X) pH7. 2 (стерильный) # 9872
  3. Вода, не содержащая нуклеаз # 12931
  4. Этанол (96-100%)
  5. Формальдегид (37% акций)
  6. SimpleChIP ® Универсальный мастер-микс для qPCR # 88989
! Это! означает важный шаг в протоколе, касающийся изменения объема в зависимости от количества препаратов иммунопреципитации (IP preps). Один препарат IP определяется как 4 x 10 6 культивируемых клеток ткани или 25 мг или дезагрегированной ткани.
!! Это !! означает важный шаг по разбавлению буфера перед продолжением.
БЕЗОПАСНЫЙ ОСТАНОВ Это безопасная точка остановки в протоколе, если остановка необходима.

I. Сшивание тканей и подготовка образцов

При заборе ткани удалите из образца нежелательный материал, такой как жир и некротический материал. Затем ткань можно обработать и сразу же сшить или заморозить на сухом льду и хранить при -80 ° C для дальнейшей обработки. Для оптимального выхода хроматина и результатов ChIP используйте 25 мг ткани для каждой иммунопреципитации. Выход хроматина действительно варьируется в зависимости от типа ткани, и для некоторых тканей может потребоваться более 25 мг для каждой иммунопреципитации. См. Приложение A для получения дополнительной информации об ожидаемом выходе хроматина для различных типов тканей. Один дополнительный образец хроматина должен быть обработан для анализа переваривания и концентрации хроматина (раздел IV). При желании следует обработать пять дополнительных образцов хроматина для оптимизации расщепления хроматина (Приложение B).

Перед запуском:

(!) Все объемы буфера должны быть увеличены пропорционально количеству подготовленных IP в эксперименте.

  • Удалите и нагрейте 200-кратный коктейль с ингибитором протеазы (PIC) и 10-кратный раствор глицина. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
  • Приготовьте 3 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) + 15 мкл 200X PIC на 25 мг ткани, подлежащей обработке, и поместите на лед.
  • Приготовьте 45 мкл 37% формальдегида на 25 мг ткани, подлежащей обработке, и храните при комнатной температуре.Используйте свежий формальдегид, срок годности которого не истек.
A. Сшивка
  1. Взвесьте свежий или замороженный образец ткани. Используйте 25 мг ткани для каждого выполняемого IP (для одного эксперимента требуется не менее 75 мг ткани, чтобы включить положительный и отрицательный контроли).
  2. Поместите образец ткани в чашку диаметром 60 или 100 мм и мелко измельчите чистым скальпелем или бритвенным лезвием. Держите блюдо на льду. Важно держать ткани в холоде, чтобы избежать деградации белков.
  3. Перенесите измельченную ткань в коническую пробирку на 15 мл.
  4. Добавьте 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани в коническую пробирку.
  5. Чтобы сшить белки с ДНК, добавьте 45 мкл 37% формальдегида на 1 мл PBS + PIC и встряхните при комнатной температуре в течение 20 мин. Конечная концентрация формальдегида составляет 1,5%.
  6. Остановите перекрестное связывание, добавив 100 мкл 10X глицина на 1 мл PBS + PIC, и перемешайте в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Центрифугируйте ткань при 500 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
  8. Удалите супернатант и промойте один раз 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани.
  9. Повторите центрифугирование при 500 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
  10. Удалите супернатант и ресуспендируйте ткань в 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани и храните на льду. Разбейте ткань на суспензию отдельных клеток, используя Medimachine (Часть B) или гомогенизатор Даунса (Часть C). (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -80 ° C перед дезагрегацией до 3 месяцев.
B. Дезагрегация тканей с использованием Medimachine от BD Biosciences (номер детали 340587)
  1. Отрежьте конец наконечника пипетки на 1000 мкл, чтобы увеличить отверстие для переноса кусочков ткани.
  2. Перенесите 1 мл ткани, ресуспендированной в PBS + PIC, в верхнюю камеру 50 мм medicone (деталь № 340592).
  3. Растереть ткань в течение 2 минут в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Соберите клеточную суспензию из нижней камеры медикона с помощью шприца на 1 мл и тупой иглы 18 калибра.Перенести клеточную суспензию в коническую пробирку на 15 мл и поместить на лед.
  5. Повторяйте шаги 2–4, пока вся ткань не превратится в гомогенную суспензию.
  6. Если необходимо дополнительное измельчение, добавьте в ткань больше PBS + PIC. Повторяйте шаги 2–5, пока вся ткань не будет измельчена до однородной суспензии.
  7. Проверьте суспензию отдельных клеток под микроскопом (необязательно).
  8. Центрифугируйте клетки при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
  9. Удалите супернатант из клеток и продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).
C. Дезагрегация тканей с использованием гомогенизатора Dounce
  1. Перенесите ткань, ресуспендированную в PBS + PIC, в гомогенизатор Даунса.
  2. Разбейте кусочки ткани 20-25 движениями. Проверьте суспензию одноклеточных с помощью микроскопа (необязательно).
  3. Перенесите суспензию клеток в коническую пробирку на 15 мл и центрифугируйте при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
  4. Удалите супернатант из клеток и продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).

II. Сшивание культур клеток и подготовка образцов

Для получения оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно 4 X 10 6 клеток для каждой иммунопреципитации (требуется не менее 12 X 10 6 клеток для включения положительного и отрицательного контролей). Для клеток HeLa один IP эквивалентен половине 15-см культуральной чашки, содержащей 90% конфлюэнтных клеток в 20 мл питательной среды. Один дополнительный образец должен быть обработан для анализа расщепления и концентрации хроматина (Раздел IV).Поскольку каждый тип клеток отличается, мы рекомендуем включить в эксперимент одну дополнительную чашку с клетками, которая будет использоваться для определения количества клеток с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.

Перед запуском

(!) Все объемы буфера должны быть увеличены пропорционально количеству используемых чашек для культивирования тканей диаметром 15 см (или 20 мл суспензионных клеток).

  • Удалите и нагрейте 200-кратный коктейль ингибиторов протеазы (PIC) №7012 и 10-кратный раствор глицина № 7005. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
  • Приготовьте 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) + 10 мкл 200X PIC на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и поместите на лед.
  • Приготовьте 40 мл PBS на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и поместите на лед.
  • Приготовьте 540 мкл 37% формальдегида на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и храните при комнатной температуре. Используйте свежий формальдегид, срок годности которого не истек.
  1. Для сшивания белков с ДНК добавьте 540 мкл 37% формальдегида в каждую 15-сантиметровую культуральную чашку, содержащую 20 мл среды.Для суспензионных клеток добавьте 540 мкл 37% формальдегида к клеткам, суспендированным в 20 мл среды (для оптимальной фиксации суспензионных клеток плотность клеток должна быть менее 0,5 x 10 6 клеток / мл при фиксации). Коротко встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация формальдегида составляет 1%. Добавление формальдегида может привести к изменению цвета среды.
  2. Добавьте 2 мл 10-кратного глицина в каждую 15-сантиметровую чашку, содержащую 20 мл среды, быстро встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.Добавление глицина может привести к изменению цвета среды.
  3. Для суспензионных клеток перенесите клетки в коническую пробирку на 50 мл, центрифугируйте при 500 x g в настольной центрифуге 5 мин при 4 ° C и дважды промойте осадок 20 мл ледяного PBS. Удалите супернатант и немедленно продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (раздел III).
  4. Для прилипших клеток удалите среду и дважды промойте клетки 20 мл ледяного 1X PBS, каждый раз полностью удаляя смыв из чашки для культивирования.
  5. Добавьте 2 мл ледяного PBS + PIC в каждую 15-сантиметровую чашку. Соскребите клетки в холодный буфер. Объедините клетки из всех чашек для культивирования в одну коническую пробирку на 15 мл.
  6. Центрифугируйте клетки при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и немедленно продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (раздел III). (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -80 ° C до 3 месяцев.

III. Подготовка ядер и расщепление хроматина

Перед запуском

(!) Все объемы буфера должны быть увеличены пропорционально количеству подготовленных IP в эксперименте.

  1. Ресуспендируйте клетки в 1 мл ледяного 1X буфера A + DTT + PIC на IP преп. Инкубируйте на льду 10 мин. Перемешивайте, переворачивая пробирку каждые 3 мин.
  2. Зародыши гранул центрифугированием при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл ледяного 1X буфера B + DTT на IP преп. Повторите центрифугирование, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 мкл 1X буфера B + DTT на IP преп. Перенесите образец в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл, всего до 1 мл на пробирку.
  3. Добавьте 0,5 мкл микрококковой нуклеазы № 10011 на препарат IP, перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте в течение 20 мин при 37 ° C с частым перемешиванием для расщепления ДНК до длины приблизительно 150-900 п.н. Перемешивайте каждые 3-5 мин. Количество микрококковой нуклеазы, необходимое для переваривания ДНК до оптимальной длины, может потребоваться эмпирически для определения отдельных тканей и клеточных линий (см. Приложение B). Ядра HeLa, расщепленные 0,5 мкл микрококковой нуклеазы на 4 × 10 6 клеток, и ткань печени мыши, переваренная 0.5 мкл микрококковой нуклеазы на 25 мг ткани давали фрагменты ДНК соответствующей длины.
  4. Остановите переваривание, добавив 10 мкл 0,5 М EDTA # 7011 на препарат IP и поместив пробирку на лед на 1-2 мин.
  5. Зародыши гранул центрифугированием при 16000 x g в микроцентрифуге в течение 1 мин при 4 ° C и удалением супернатанта.
  6. Ресуспендируйте ядерный осадок в 100 мкл 1X ChIP Buffer + PIC на каждый IP-препарат и инкубируйте на льду в течение 10 мин.
  7. Обработка ультразвуком до 500 мкл лизата на 1,5 мл микроцентрифужную пробирку с несколькими импульсами для разрушения ядерной мембраны.Инкубируйте образцы в течение 30 секунд на влажном льду между импульсами. Оптимальные условия, необходимые для полного лизиса ядер, можно определить, наблюдая ядра под световым микроскопом до и после обработки ультразвуком. Ядра HeLa были полностью лизированы после 3 серий 20-секундных импульсов с использованием ультразвукового гомогенизатора / соникатора VirTis Virsonic 100 при настройке 6 с зондом 1/8 дюйма. Альтернативно ядра можно лизировать путем 20-кратной гомогенизации лизата в гомогенизаторе Даунса; однако лизис может быть не таким полным.
  8. Очистите лизаты центрифугированием при 9400 x g в микроцентрифуге в течение 10 минут при 4 ° C.
  9. Перенесите супернатант в новую пробирку. (БЕЗОПАСНЫЙ СТОП) Это препарат сшитого хроматина, который следует хранить при -80 ° C до дальнейшего использования. Удалите 50 мкл препарата хроматина для анализа переваривания и концентрации хроматина (раздел IV). Этот образец объемом 50 мкл можно хранить при -20 ° C в течение ночи.

IV. Анализ переваривания и концентрации хроматина (рекомендуемый этап)

  1. К 50 мкл образца хроматина (из шага 9 в разделе III) добавьте 100 мкл воды, свободной от нуклеаз, 6 мкл 5 M NaCl № 7010 и 2 мкл РНКазы A № 7013.Вортекс для смешивания и инкубирования образцов при 37 ° C в течение 30 мин.
  2. К каждому образцу, расщепленному РНКазой A, добавьте 2 мкл протеиназы K. Вортекс перемешайте и инкубируйте образцы при 65 ° C в течение 2 часов.
  3. Очистите ДНК из образцов, используя спин-колонки для очистки ДНК, как описано в разделе VII. (БЕЗОПАСНЫЙ СТОП) ДНК можно хранить при -20 ° C до 6 месяцев.
  4. После очистки ДНК удалите образец объемом 10 мкл и определите размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза на 1% агарозном геле с маркером ДНК 100 п.н.ДНК должна быть переварена до длины примерно 150-900 п.н. (от 1 до 5 нуклеосом).
  5. Чтобы определить концентрацию ДНК, перенесите 2 мкл очищенной ДНК в 98 мкл воды, свободной от нуклеаз, чтобы получить 50-кратное разведение, и прочитайте OD 260 . Концентрация ДНК в мкг / мл составляет OD 260 x 2500. В идеале концентрация ДНК должна составлять от 50 до 200 мкг / мл.

ПРИМЕЧАНИЕ : Для оптимальных результатов ChIP очень важно, чтобы хроматин имел соответствующий размер и концентрацию.Избыточное переваривание хроматина может уменьшить сигнал при количественной оценке ПЦР. Недостаточное переваривание хроматина может привести к усилению фонового сигнала и снижению разрешения. Добавление слишком малого количества хроматина к IP может привести к снижению сигнала при количественной оценке ПЦР. Протокол оптимизации переваривания хроматина можно найти в Приложении B.

V. Иммунопреципитация хроматина

Для оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно от 5 до 10 мкг расщепленного сшитого хроматина (как определено в разделе IV) на иммунопреципитацию.Это должно быть примерно эквивалентно одной 100 мкл IP-препарата из 25 мг дезагрегированной ткани или 4 x 10 6 клеток культуры ткани. Обычно 100 мкл расщепленного хроматина разводят в 400 мкл 1X ChIP Buffer перед добавлением антител. Однако, если на IP требуется более 100 мкл хроматина, препарат сшитого хроматина не нужно разбавлять, как описано ниже. Антитела можно добавлять непосредственно в неразбавленный препарат хроматина для иммунопреципитации хроматиновых комплексов.

Перед запуском

(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству иммунопреципитации в эксперименте.

  • Удалите и нагрейте коктейль с 200-кратным ингибитором протеазы (PIC) # 7012. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
  • Удалите и нагрейте 10X ChIP Buffer # 7008 и убедитесь, что SDS полностью растворен.
  • Оттаять расщепленный препарат хроматина (из шага 9 в разделе III) и поместить на лед.
  • Приготовьте промывку с низким содержанием соли: 3 мл 1X ChIP Buffer (300 мкл 10X ChIP Buffer # 7008 + 2.7 мл воды) на иммунопреципитацию. Хранить при комнатной температуре до использования.
  • Приготовьте промывку с высоким содержанием соли: 1 мл 1X буфера ChIP (100 мкл 10X буфера ChIP # 7008 + 900 мкл воды) + 70 мкл 5M NaCl # 7010 на иммунопреципитацию. Хранить при комнатной температуре до использования.
  1. В одной пробирке приготовьте достаточное количество 1X ChIP-буфера для разведения расщепленного хроматина до желаемого количества иммунопреципитаций: 400 мкл 1X ChIP-буфера (40 мкл 10X ChIP-буфера + 360 мкл воды) + 2 мкл 200X PIC на каждую иммунопреципитацию .При определении количества иммунопреципитации не забудьте включить образцы положительного контроля гистона h4 (D2B12) XP ® мАт кролика № 4620 и отрицательного контроля нормального антитела кролика IgG № 2729. Выложите смесь на лед.
  2. К приготовленному буферу 1X ChIP добавьте эквивалент 100 мкл (от 5 до 10 мкг хроматина) расщепленного препарата сшитого хроматина (из этапа 9 в разделе III) на иммунопреципитацию. Например, для 10 иммунопреципитации подготовьте пробирку, содержащую 4 мл 1X ChIP Buffer (400 мкл 10X ChIP Buffer + 3.6 мл воды) + 20 мкл 200X PIC + 1 мл препарата расщепленного хроматина.
  3. Удалите 10 мкл образца разбавленного хроматина и перенесите в пробирку для микроцентрифугирования. Это ваш 2% входной образец, который можно хранить при -20 ° C до дальнейшего использования (шаг 1 в разделе VI).
  4. Для каждой иммунопреципитации перенесите 500 мкл разбавленного хроматина в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и добавьте иммунопреципитирующие антитела. Количество антител, необходимое для одного IP, варьируется и должно определяться пользователем.Для положительного контроля гистона h4 (D2B12) XP ® Кроличье мАт № 4620 добавьте 10 мкл к образцу IP. Для отрицательного контроля Нормальный кроличий IgG # 2729 добавьте 1 мкл (1 мкг) к 2 мкл (2 мкг) к образцу IP. При использовании антител от Cell Signaling Technology см. Рекомендуемые разведения, указанные в таблице данных или на веб-странице продукта, и рассчитайте количество (мкг) антител IgG для отрицательного контроля на основе концентрации сигнальных антител для сравнения. Инкубируйте образцы IP от 4 ч до ночи при 4 ° C с вращением.

    ПРИМЕЧАНИЕ : Большинство антител от Cell Signaling Technology оптимально работают между 1 и 2 мкг на образец IP. В случае, когда имеется несколько образцов с различными концентрациями, лучше всего сопоставить отрицательный контроль нормального кроличьего IgG # 2729 с наивысшей концентрацией антител.

  5. Ресуспендируйте магнитные шарики с протеином G класса ChIP №9006, осторожно встряхивая. Немедленно добавьте 30 мкл магнитных шариков с протеином G в каждую реакцию IP и инкубируйте в течение 2 ч при 4 ° C с вращением.
  6. Осадок на магнитных гранулах белка G при каждой иммунопреципитации, помещая пробирки в стойку для магнитного разделения # 7017. Подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант.
  7. Вымойте магнитные шарики с протеином G, добавив к шарикам 1 мл промывного раствора с низким содержанием соли, и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении. Повторите шаги 6 и 7 еще два раза, всего 3 промывки с низким содержанием соли.
  8. Добавьте к шарикам 1 мл промывного раствора с высоким содержанием соли и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении.
  9. Осадок на магнитных гранулах с белком G при каждой иммунопреципитации, помещая пробирки в магнитную разделительную стойку. Подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант. Сразу переходите к разделу VI.

VI. Элюция хроматина с магнитных шариков антитело / белок G и изменение поперечных сшивок

Перед запуском

(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству иммунопреципитации в эксперименте.

  • Удалите и нагрейте 2X ChIP Elution Buffer # 7009 на водяной бане с температурой 37 ° C и убедитесь, что SDS находится в растворе.
  • Установите водяную баню или термомиксер на 65 ° C.
  • Приготовьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP (75 мкл буфера для элюции 2X ChIP № 7009 + 75 мкл воды) для каждой иммунопреципитации и 2% входного образца.
  1. Добавьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP в пробирку с образцом для ввода 2% и отставьте при комнатной температуре до этапа 6.
  2. Добавьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP в каждый образец IP.
  3. Элюируйте хроматин с магнитных шариков антитела / протеина G в течение 30 мин при 65 ° C с осторожным встряхиванием (1200 об / мин). На этом этапе лучше всего подходит термомиксер. В качестве альтернативы элюирование можно проводить при комнатной температуре с вращением, но оно может быть не таким полным.
  4. Осадок белка G на магнитных гранулах, поместив пробирки в стойку для магнитного разделения и подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным.
  5. Осторожно перенесите элюированный супернатант хроматина в новую пробирку.
  6. Во все пробирки, включая 2% -ный образец, полученный на этапе 1, выполните обратные перекрестные связи, добавив 6 мкл 5M NaCl и 2 мкл протеиназы K # 10012, и инкубируйте 2 часа при 65 ° C.Инкубацию можно продлить на ночь.
  7. Сразу переходите к Разделу VII. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -20 ° C до 4 дней. Однако, чтобы избежать образования осадка, обязательно нагрейте образцы до комнатной температуры перед добавлением ДНК-связывающего буфера №10007 (раздел VII, этап 1).

VII. Очистка ДНК с использованием спиновых колонок

Перед запуском
  • (!!) Добавьте 24 мл этанола (96–100%) в буфер для промывки ДНК №10008 перед использованием.Этот шаг необходимо выполнить только один раз перед первым набором очистки ДНК.
  • Удалите по одной пробирке для сбора образцов для очистки ДНК №10010 для каждого образца ДНК из Раздела V.
  1. Добавьте 750 мкл буфера для связывания ДНК №10007 в каждый образец ДНК и быстро встряхните.
    • На каждый 1 объем образца следует использовать 5 объемов буфера для связывания ДНК.
  2. Перенесите 450 мкл каждого образца из этапа 1 на спин-колонку ДНК в пробирке для сбора.
  3. Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
  4. Снимите спин-колонку с пробирки для сбора и слейте жидкость. Замените спин-колонку в сборной трубке.
  5. Перенесите оставшиеся 450 мкл каждого образца из этапа 1 в спин-колонку в пробирке для сбора. Повторите шаги 3 и 4.
  6. Добавьте 750 мкл буфера для промывки ДНК №10008 в спин-колонку в пробирке для сбора.
  7. Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
  8. Снимите спин-колонку с пробирки для сбора и слейте жидкость. Замените спин-колонку в сборной трубке.
  9. Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
  10. Удалить пробирку для сбора и жидкость. Сохраните спин-колонку.
  11. Добавьте 50 мкл буфера для элюции ДНК №10009 в каждую спин-колонку и поместите в чистую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл.
  12. Центрифуга при 18000 х g в микроцентрифуге в течение 30 секунд для элюирования ДНК.
  13. Удалите и утилизируйте спин-колонку с ДНК.Элюат теперь представляет собой очищенную ДНК. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) Образцы можно хранить при -20 ° C.

VIII. Количественное определение ДНК методом ПЦР

Рекомендации
  • Используйте наконечники для пипеток с фильтром, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.
  • Контрольные праймеры, включенные в набор, специфичны для гена RPL30 человека или мыши (№7014 + №7015) и могут использоваться либо для стандартной ПЦР, либо для количественной ПЦР в реальном времени. Если пользователь выполняет ChIPs от другого вида, рекомендуется, чтобы пользователь разработал соответствующие специфические праймеры для ДНК и определил оптимальные условия ПЦР.
  • Полимераза Hot-Start Taq рекомендуется для минимизации риска неспецифических продуктов ПЦР.
  • Выбор праймера для ПЦР имеет решающее значение. Праймеры должны разрабатываться с точным соблюдением следующих критериев:
Длина праймера: 24 нуклеотида
Оптимальная температура пл .: 60 ° C
Оптимальный ГХ: 50%
Размер ампликона: От 150 до 200 п.н. (для стандартной ПЦР)
от 80 до 160 пар оснований (для количественной ПЦР в реальном времени)

Стандартный метод ПЦР

  1. Обозначьте соответствующее число 0.2 мл пробирки для ПЦР для количества анализируемых образцов. Они должны включать 2% входной образец, положительный контрольный образец гистона h4, отрицательный контрольный образец нормального кроличьего IgG и пробирку без ДНК для контроля загрязнения ДНК.
  2. Добавьте 2 мкл соответствующего образца ДНК в каждую пробирку.
  3. Приготовьте основную реакционную смесь, как описано ниже, убедившись, что добавлено достаточно реагента для двух дополнительных пробирок, чтобы учесть потерю объема. Добавьте 18 мкл мастер-микса в каждую реакционную пробирку.
Реагент Объем для 1 реакции ПЦР (18 мкл)
Без нуклеаз H 2 O 12,5 мкл
10X Буфер для ПЦР 2,0 мкл
4 мМ dNTP Mix 1,0 мкл
5 мкМ RPL30 Праймеры 2,0 мкл
ДНК-полимераза Taq 0,5 мкл
  1. Запустите следующую программу реакции ПЦР:
а. Начальная денатурация 95 ° C 5 мин
б. Денатурация 95 ° C 30 сек
с. Отжиг 62 ° C 30 сек
г. Расширение 72 ° C 30 сек
эл. Повторите шаги b-d всего 34 цикла.
ф. Окончательное расширение 72 ° C 5 мин
  1. Удалите 10 мкл каждого продукта ПЦР для анализа с помощью электрофореза в 2% агарозном геле или 10% полиакриламидном геле с маркером ДНК 100 п.н.Ожидаемый размер продукта ПЦР составляет 161 п.н. для RPL30 # 7014 человека и 159 п.н. для RPL30 # 7015 мыши.

Метод количественной ПЦР в реальном времени

  1. Пометьте соответствующее количество пробирок для ПЦР или планшетов для ПЦР, совместимых с моделью используемого ПЦР-аппарата. Реакции ПЦР должны включать образец гистона h4 положительного контроля, образец нормального кроличьего IgG отрицательного контроля, пробирку без ДНК для контроля контаминации и серийное разведение 2% входящей ДНК хроматина (неразбавленной, 1: 5, 1:25). , 1: 125), чтобы построить стандартную кривую и определить эффективность усиления.
  2. Добавьте 2 мкл соответствующего образца ДНК в каждую пробирку или лунку планшета для ПЦР.
  3. Приготовьте основную реакционную смесь, как описано ниже. Добавьте достаточно реагентов для двух дополнительных реакций, чтобы учесть потерю объема. Добавьте 18 мкл реакционной смеси в каждую реакционную пробирку или лунку для ПЦР. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) При необходимости накройте пластину алюминиевой фольгой во избежание попадания света и храните при 4 ° C до 4 часов или -20 ° C в течение ночи, пока машина не будет готова к использованию.
Реагент Объем для 1 реакции ПЦР (18 мкл)
Без нуклеаз H 2 O 6 мкл
5 мкМ RPL30 Праймеры 2 мкл
SimpleChIP ® Universal qPCR Master Mix # 88989 10 мкл
  1. Запустите следующую программу реакции ПЦР:
а. Начальная денатурация 95 ° C 3 мин
б. Денатурация 95 ° C 15 сек
с. Отжиг и удлинение: 60 ° C 60 сек
г. Повторите шаги b и c всего 40 циклов.

  1. Проанализируйте количественные результаты ПЦР с помощью программного обеспечения, поставляемого с аппаратом ПЦР в реальном времени. В качестве альтернативы можно рассчитать эффективность IP вручную, используя метод процентного ввода и уравнение, показанное ниже.С помощью этого метода сигналы, полученные от каждой иммунопреципитации, выражаются в процентах от общего входящего хроматина.

    Процент ввода = 2% x 2 (C [T] 2% входной выборки – C [T] IP выборки)

    C [T] = C T = Пороговый цикл реакции ПЦР

IX. Создание библиотеки NG-секвенирования

Иммунообогащенные образцы ДНК, полученные с помощью этого набора, напрямую совместимы с ChIP-seq. Для создания библиотеки ДНК для последующего секвенирования NG используйте протокол или набор для подготовки библиотеки ДНК, совместимый с вашей платформой для последующего секвенирования.Для секвенирования на платформах Illumina ® мы рекомендуем SimpleChIP ® ChIP-seq DNA Library Prep Kit для Illumina ® # 56795 и связанных с ним индексных праймеров SimpleChIP ® ChIP-seq Multiplex Oligos для Illumina ® (одиночный Индексные праймеры) # 29580 или SimpleChIP ® ChIP-seq Multiplex Oligos для Illumina ® (двойные индексные праймеры) # 47538.

Рекомендации:

  • Для фактора транскрипции или кофактора ChIP-seq используйте не менее 5 нг ДНК, обогащенной ChIP, и амплификацию ДНК с лигированием адаптера с помощью 10 циклов ПЦР.
  • Для полных модификаций гистонов и гистонов или вводимых образцов начните с 50 нг ДНК, обогащенной ChIP, и амплификации ДНК с лигированием адаптера с 6 циклами ПЦР.
  • Для создания библиотеки ChIP-обогащенной ДНК для всех типов мишеней выполните очистку ДНК, лигированной адаптером, без выбора размера.
  • После создания библиотеки ДНК проверьте библиотеку ДНК на наличие димеров адаптера (~ 140 п.н.) с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Cat # G2938-
    • ) или с помощью электрофореза в агарозном геле с 50-100 нг ДНК на 2% агарозный гель TAE.Если димеры адаптера присутствуют в библиотеке ДНК, повторите очистку ПЦР-амплифицированного материала.
  • Качество библиотеки также можно подтвердить с помощью количественной ПЦР и наборов праймеров для известных положительных и отрицательных целевых локусов. Положительные пары праймеров должны по-прежнему давать такой же высокий сигнал по сравнению с отрицательными праймерами, как это видно в исходном анализе qPCR ДНК, обогащенной ChIP.
  • После окончательной очистки и проверки качества подготовьте окончательные очищенные образцы библиотеки при 2–10 нМ для высокопроизводительного секвенирования.

ПРИЛОЖЕНИЕ A: Ожидаемый выход хроматина

При сборе сшитого хроматина из образцов ткани выход хроматина может значительно различаться между типами тканей. В таблице справа представлен диапазон ожидаемого выхода хроматина из 25 мг ткани по сравнению с 4 x 10 6 клеток HeLa и ожидаемой концентрации ДНК, как определено в разделе IV протокола. Для каждого типа ткани дезагрегация с использованием Medimachine (BD Biosciences) или гомогенизатора Даунса давала аналогичные количества хроматина.Однако хроматин, обработанный из тканей, дезагрегированных с использованием Medimachine, обычно давал более высокую IP-эффективность, чем хроматин, обработанный из тканей, дезагрегированных с использованием гомогенизатора Даунса. Гомогенизатор Даунса настоятельно рекомендуется для дезагрегации мозговой ткани, поскольку Medimachine не может адекватно дезагрегировать мозговую ткань в одноклеточную суспензию. Для получения оптимальных результатов ChIP мы рекомендуем использовать от 5 до 10 мкг расщепленного сшитого хроматина на одну иммунопреципитацию; поэтому для некоторых тканей может потребоваться сбор более 25 мг на каждую иммунопреципитацию.

Ткань / клетка Общий выход хроматина Ожидаемая концентрация ДНК
Селезенка 20-30 мкг на 25 мг ткани 200-300 мкг / мл
Печень 10-15 мкг на 25 мг ткани 100-150 мкг / мл
Почки 8-10 мкг на 25 мг ткани 80-100 мкг / мл
Мозг 2-5 мкг на 25 мг ткани 20-50 мкг / мл
Сердце 2-5 мкг на 25 мг ткани 20-50 мкг / мл
HeLa 10-15 мкг на 4 x 10 6 клеток 100-150 мкг / мл

ПРИЛОЖЕНИЕ B: Оптимизация расщепления хроматина

Оптимальные условия для расщепления сшитой ДНК хроматина до 150-900 пар оснований в значительной степени зависят от отношения микрококковой нуклеазы к количеству ткани или количеству клеток, используемых для переваривания.Ниже приведен протокол определения оптимальных условий пищеварения для конкретной ткани или типа клеток.

  1. Приготовьте сшитые ядра из 125 мг ткани или 2 X 10 7 клеток (эквивалент 5 препаратов IP), как описано в разделах I, II и III. Остановитесь после шага 2 раздела III и действуйте, как описано ниже.
  2. Перенесите 100 мкл препарата ядер в 5 отдельных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и поместите на лед.
  3. Добавьте 3 мкл исходного раствора микрококковой нуклеазы к 27 мкл 1X буфера B + DTT (разведение фермента 1:10).
  4. В каждую из 5 пробирок на этапе 2 добавьте 0 мкл, 2,5 мкл, 5 мкл, 7,5 мкл или 10 мкл разведенной нуклеазы микрококка, перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте в течение 20 мин при 37 ° C с частыми смешивание.
  5. Остановите каждый процесс переваривания, добавив 10 мкл 0,5 М ЭДТА и поместив пробирки на лед.
  6. Зародыши гранул центрифугированием при 16000 x g в микроцентрифуге в течение 1 мин при 4 ° C и удалением супернатанта.
  7. Ресуспендировать ядерный осадок в 200 мкл 1X ChIP Buffer + PIC.Инкубируйте на льду 10 мин.
  8. Обработка лизата ультразвуком с несколькими импульсами для разрушения ядерной мембраны. Инкубируйте образцы 30 секунд на влажном льду между импульсами. Оптимальные условия, необходимые для полного лизиса ядер, можно определить, наблюдая ядра под световым микроскопом до и после обработки ультразвуком. Ядра HeLa были полностью лизированы после 3 серий 20-секундных импульсов с использованием ультразвукового гомогенизатора / соникатора VirTis Virsonic 100, установленного на настройку 6 с помощью зонда 1/8 дюйма. Альтернативно ядра можно лизировать путем 20-кратной гомогенизации лизата в гомогенизаторе Даунса; однако лизис может быть не таким полным.
  9. Очистите лизаты центрифугированием при 9400 x g в микроцентрифуге в течение 10 минут при 4 ° C.
  10. Перенесите по 50 мкл каждого лизата, обработанного ультразвуком, в новые микроцентрифужные пробирки.
  11. К каждому 50 мкл образца добавьте 100 мкл воды, свободной от нуклеаз, 6 мкл 5 M NaCl и 2 мкл РНКазы A. Вихревым движением перемешайте и инкубируйте образцы при 37 ° C в течение 30 мин.
  12. К каждому образцу, расщепленному РНКазой A, добавьте 2 мкл протеиназы K. Вортекс перемешайте и инкубируйте образец при 65 ° C в течение 2 часов.
  13. Удалите 20 мкл каждого образца и определите размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с маркером ДНК 100 п.н.
  14. Наблюдайте, при каких условиях переваривания образуется ДНК в желаемом диапазоне от 150 до 900 пар оснований (от 1 до 5 нуклеосом). Объем разбавленной микрококковой нуклеазы, который дает желаемый размер фрагментов ДНК с использованием этого протокола оптимизации, эквивалентен 10-кратному объему исходного раствора микрококковой нуклеазы, который должен быть добавлен к одному препарату для иммунопреципитации (25 мг дезагрегированных тканевых клеток или 4 × 10 6). клеток культуры ткани) для получения фрагментов ДНК желаемого размера.Например, если 5 мкл разбавленной микрококковой нуклеазы продуцируют фрагменты ДНК из 150-900 пар оснований в этом протоколе, то 0,5 мкл исходной микрококковой нуклеазы следует добавить к одному препарату IP во время переваривания хроматина в разделе III.
  15. Если результаты показывают, что размер ДНК не соответствует желаемому диапазону, то повторите протокол оптимизации, соответствующим образом регулируя количество микрококковой нуклеазы в каждом гидролизате. В качестве альтернативы время переваривания можно изменить, чтобы увеличить или уменьшить степень фрагментации ДНК.

ПРИЛОЖЕНИЕ C: Руководство по поиску и устранению неисправностей

Проблема Возможные причины Рекомендация
1. Слишком низкая концентрация расщепленного хроматина. Для переваривания хроматина добавлено недостаточно клеток или ядра не были полностью лизированы после переваривания.

Если концентрация ДНК в препарате хроматина близка к 50 мкг / мл, добавьте дополнительный хроматин к каждому IP, чтобы получить не менее 5 мкг / IP, и продолжайте выполнение протокола.

Подсчитайте отдельные клетки перед сшивкой, чтобы определить точное количество клеток и / или визуализировать ядра под микроскопом до и после обработки ультразвуком, чтобы подтвердить полный лизис ядер.

2. Хроматин недостаточно переварен, а фрагменты слишком большие (более 900 п.н.).

Возможно, клетки были чрезмерно сшиты. Перекрестное сшивание более 10 мин может ингибировать переваривание хроматина.

Для расщепления хроматина было добавлено слишком много клеток или недостаточно микрококковой нуклеазы.

Выполните временной график при фиксированной концентрации формальдегида. Сократите время сшивания до 10 минут или меньше.

Подсчитайте количество клеток на отдельной пластине перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток, и см. Приложение B для оптимизации расщепления хроматина.

3. Хроматин переваривается, и фрагменты слишком малы (длина мононуклеосомы составляет исключительно 150 п.н.). Полное расщепление хроматина до мононуклеосомной ДНК может уменьшить сигнал во время количественной оценки ПЦР, особенно для ампликонов длиной более 150 п.н. К расщеплению хроматина добавлено недостаточно клеток или слишком много микрококковой нуклеазы. Подсчитайте количество клеток на отдельной пластине перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток, и см. Приложение B для оптимизации расщепления хроматина.
4. Нет продукта или очень мало продукта во входных реакциях ПЦР.

В реакцию ПЦР добавлено недостаточно ДНК или условия не оптимальны.

Область амплификации ПЦР может охватывать область, свободную от нуклеосом.

К IP добавлено недостаточно хроматина или хроматин переваривается.

Добавьте больше ДНК в реакцию ПЦР или увеличьте количество циклов амплификации.

Оптимизируйте условия ПЦР для экспериментального набора праймеров, используя очищенную ДНК из сшитого и расщепленного хроматина. Разработайте другой набор праймеров и уменьшите длину ампликона до менее 150 п.н. (см. Рекомендации по созданию праймеров в разделе VIII).

Для оптимальных результатов ChIP добавьте 5-10 мкг хроматина на IP.См. Рекомендации по проблемам 1 и 3 выше.

5. В положительном контроле нет продукта. ПЦР-реакция гистона h4-IP RPL30.

В реакцию IP добавлено недостаточно хроматина или антител или время инкубации IP слишком короткое.

Неполное элюирование хроматина с гранул белка G.

Обязательно добавьте 5-10 мкг хроматина и 10 мкл антитела в каждую реакцию IP и инкубируйте с антителом в течение ночи и еще 2 часа после добавления шариков с протеином G.

Элюция хроматина из шариков с протеином G оптимальна при 65 ° C с частым перемешиванием, чтобы шарики оставались суспендированными в растворе.

6. Количество продукта в отрицательном контроле IgG-IP кролика и положительном контроле ПЦР-реакции на гистон h4-IP эквивалентно.

В реакцию IP добавлено слишком много или недостаточно хроматина. В качестве альтернативы, в реакцию IP добавлено слишком много антител.

Слишком много ДНК добавлено в реакцию ПЦР или слишком много циклов амплификации.

Добавьте не более 15 мкг хроматина и 10 мкл антитела к гистону h4 в каждую реакцию IP. Уменьшите количество нормального кроличьего IgG до 1 мкл на IP.

Добавьте меньше ДНК в реакцию ПЦР или уменьшите количество циклов ПЦР. Очень важно, чтобы продукты ПЦР анализировались в рамках фазы линейной амплификации ПЦР. В противном случае невозможно точно измерить разницу в количествах исходной ДНК.

7. Нет продукта в реакции ПЦР экспериментальное антитело-IP.

В реакцию ПЦР добавлено недостаточно ДНК.

В реакцию IP добавлено недостаточно антител.

Антитело не работает для IP.

Добавьте больше ДНК в реакцию ПЦР или увеличьте количество циклов амплификации.

Обычно к реакции IP добавляют от 1 до 5 мкг антитела; однако точное количество сильно зависит от индивидуального антитела.

Увеличьте количество антител, добавленных к IP. Найдите альтернативный источник антител.

, опубликовано в декабре 2011 г.

Пересмотрено в июне 2018 г.

Цвет шерсти Панда Белая пятнистость

Предпосылки

В течение последних десятилетий большое количество научных публикаций описывало генетические принципы окраски и вариаций шерсти. На окрас и вариации шерсти влияют многие наследственные факторы. ДНК-тесты основаны на физиологических эффектах в организме, при которых производство и распределение пигментов приводит к появлению множества вариантов окраски шерсти.В некоторых случаях определить цвет шерсти животного можно только с помощью ДНК-тестов.

Мутация в гене KIT связана с рисунком белых пятен у немецких овчарок, этот паттерн также называют пятнистостью панды. Мутация возникла совсем недавно, она возникла спонтанно у самки, родившейся в 2000 году. Ген белых пятен известен как S-локус (MITF-Gene), однако у немецких овчарок эта мутация находится в другом гене, чем у немецких овчарок. мутация, вызывающая белые пятна у других пород собак.Мутация вызывает белые отметины на морде, конечностях, животе, шее и кончике хвоста, причем белый цвет концентрируется ближе к передней части собаки, как ирландский узор пятен. Количество белого может варьироваться от собаки к собаке. Мутация, которая вызывает паттерн Panda White у немецких овчарок, находится в гомозиготном состоянии (две копии мутации), что считается эмбрионально летальным, поскольку живых собак с этим паттерном и с двумя копиями мутации не наблюдалось. Это означает, что детеныши, гомозиготные по мутации Panda, не развиваются в матке и реабсорбируются очень рано в процессе развития.Гетерозиготные собаки (одна копия мутации) не имеют каких-либо дефектов здоровья, связанных с паттерном Панда. Тест на окраску шерсти панда на белые пятна (h454) проверяет генетический статус KIT-гена. Этот ген имеет два варианта (аллеля), P и N. Аллель P является доминантным. Одна копия аллеля P дает собак с белым рисунком панды. Две копии аллеля P приводят к ранней гибели эмбриона. Аллель N не влияет на окрас шерсти.

Информация о тестах

С 2015 года были разработаны две марки.CombiGen® в основном предназначен для ветеринарных применений, тогда как CombiBreed® в основном направлен на заводчиков и / или владельцев. Подробная информация о цветах и ​​вариациях шерсти представлена ​​на сайте www.combibreed.com.

Возраст

Большинство окрасов и типов шерсти обычно видны сразу после рождения.

Срок выполнения

Срок выполнения (TAT) зависит от различных факторов, таких как время доставки вашего образца в место проведения испытаний, метод (методы) тестирования и от того, проводятся ли тесты полностью или частично партнерской лабораторией или Владелец патента.

Срок действия тестов, проводимых на нашем предприятии, обычно составляет 10 рабочих дней после получения образца в испытательной лаборатории (VHL, VHP или Certagen). Для тестов, проводимых партнерской лабораторией (так называемый «партнерский лабораторный тест») или владельцем патента, ТАТ составляет не менее 20 рабочих дней после получения вашего образца. Поскольку время доставки в наши партнерские лаборатории или патентообладателя может варьироваться в зависимости от факторов, на которые мы не можем повлиять, указанные 20 рабочих дней являются приблизительными.

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ:
Иногда необходимо повторно запустить образец.Мы называем это повторным тестом. В этом случае ТАТ, конечно, будет продлен.

Местоположение болезни или признака

Генетические факторы, влияющие на цвет и тип шерсти, обычно видны снаружи человека. Некоторые факторы могут быть скрыты внешними вариациями.

Породная зависимость

Этот тест ДНК доступен для следующих пород: бельгийская овчарка, голландская овчарка, немецкая овчарка. Дополнительная информация доступна в разделе часто задаваемых вопросов (FAQ).

Тип образца

Для этого теста ДНК мы принимаем следующие материалы: кровь EDTA, гепарин крови, сперма, ткань, мазок, мазок Genotek. Пожалуйста, свяжитесь с Dr. Van Haeringen Laboratorium, если вы хотите предоставить другие материалы, указанные в списке.

Результат

Цвета и типы шерсти основаны на многих генетических факторах. Для каждого фактора будет возвращен отдельный результат теста.

Наследование

Различные генетические факторы, влияющие на цвет и типы шерсти, наследуются по доминантному или рецессивному типу.На окрас шерсти влияет большое количество генетических факторов.

Тяжесть заболевания

Факторы, влияющие на цвет и тип шерсти, обычно не связаны с болезнями.

Руководство пользователя

% PDF-1.4 % 3942 0 объект > эндобдж 4439 0 объект > поток Acrobat Distiller 7.0 (Windows) XPP2007-05-30T09: 36: 32.000-05: 002007-05-30T09: 36: 32.000-05: 002007-05-25T10: 16: 34.000-05: 002014-11-02T18: 11: 42.468-06: 00Acrobat Distiller 7.0 (Windows) EDSbea7aa1578218f347a6659ff0cd561f2d2ce924c5937912application / pdf2014-11-03T10: 09: 58.208-05: 00

  • EDS
  • Руководство пользователя
    • uuid: 71b93ae8-dabc-42f5-9777-7782c3be2ce0uuid: f0d060df-9322-4a04-8028-e5c8531d022d
  • OwnerCenter: GMNA / asset_type / owner_manual
  • OwnerCenter: GMNA / 2008 / hummer / h4
    • конечный поток эндобдж 4066 0 объект > эндобдж 3889 0 объект > эндобдж 3891 0 объект > эндобдж 3892 0 объект > эндобдж 3903 0 объект > эндобдж 3914 0 объект > эндобдж 3925 0 объект > эндобдж 3936 0 объект > эндобдж 3937 0 объект > эндобдж 3938 0 объект > эндобдж 3328 0 объект > эндобдж 3419 0 объект > эндобдж 3517 0 объект > эндобдж 3611 0 объект > эндобдж 3714 0 объект > эндобдж 3785 0 объект > эндобдж 3837 0 объект > поток HW [OH ~ GG_K (V˶j MLpqPl @? G | @ =; 9y? Hys “7 * 29qj1L; f -2D0a] JaQH = / ‘`VHu & KĉŒQL \ W \ a4NW @ Pgͳ7U 鲾.2 “. Еще 1 аналогичная замена.

    Пошаговое решение:

    Шаг 1:

    Уравнение в конце шага 1: 
     (((h  3 ) - (2 • 3h  2 )) - 9ч) + 54 = 0

    Шаг 2:

    Проверка идеального куба:

    2,1 h 3 -6h 2 -9h + 54 не идеальный куб

    Попытка разложить на множители:

    2.2 Факторинг: h 3 -6h 2 -9h + 54

    Вдумчиво разделите данное выражение на группы, каждая группа имеет два термина:

    Группа 1: -9h + 54
    Группа 2: -6h 2 + h 3

    Вытяните из каждой группы отдельно:

    Группа 1: (h-6) • (-9)
    Группа 2: (h-6) • (h 2 )
    ——- ————
    Сложите две группы:
    (h-6) • (h 2 -9)
    Какое желаемое факторизация

    Попытка разложить на множители как разность квадратов :

    2.3 Факторинг: h 2 -9

    Теория: Разность двух полных квадратов, A 2 – B 2 может быть разложена на множители (A + B) • (AB)

    Доказательство: (A + B ) • (AB) =
    A 2 – AB + BA – B 2 =
    A 2 – AB + AB – B 2 =
    A 2 – B 2

    Примечание: AB = BA – коммутативное свойство умножения.

    Примечание: – AB + AB равно нулю и поэтому исключается из выражения.

    Проверка: 9 – квадрат 3
    Проверка: h 2 – квадрат h 1

    Факторизация: (h + 3) • (h – 3)

    Уравнение в конце шага 2: 
     (h + 3) • (h - 3) • (h - 6) = 0

    Шаг 3:

    Теория – Корни продукта:

    3.1 Произведение нескольких членов равняется нулю.

    Если произведение двух или более членов равно нулю, то хотя бы один из членов должен быть равен нулю.

    Теперь мы решим каждый член = 0 отдельно

    Другими словами, мы собираемся решить столько уравнений, сколько членов есть в продукте

    Любое решение term = 0 также решает product = 0.

     Решение уравнения с одной переменной: 
     3.2 Решите: h + 3 = 0
     Вычтите 3 из обеих частей уравнения: 
     h = -3 
     
     Решение уравнения с одной переменной: 
     3.3 Решите: h-3 = 0
     Добавьте 3 к обеим сторонам уравнения: 
     h = 3 
     
     Решение уравнения с одной переменной: 
     3.

    Больше новостей

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *